Visfatin基因启动子区域的遗传变异与中国北方汉族人群缺血性卒中发病风险研究

朱瑞霞，王倩雯，刘 旭，何志义

缺血性卒中(IS)是所有卒中中最常见的类型，占卒中的70%以上[1]，其发病率、致残率、死亡率均高，严重影响人类的健康。IS是一种复杂的疾病，受到遗传和环境因素的共同影响[2]。炎症在动脉粥样硬化发生中发挥了重要作用，而动脉粥样硬化则是缺血性卒中的主要病因。Visfatin(又称前B细胞集落增强因子)是一种在内脏脂肪中明显表达的新型促炎性脂肪因子[3]。Visfatin是一种分子量为52-55kDa的蛋白质，最初发现它可以作为生长因子，增强干细胞和白介素7对于前B细胞分化的作用[4，5]。最近的研究表明，visfatin在炎症相关的动脉粥样硬化过程中发挥了重要作用。据报道，血清visfatin水平与血清中IL-6和IL-1β及TNF-α的水平呈正相关，表明循环的visfatin可能影响了炎症状态[6，7]。Visfatin还被证明其可能对斑块不稳定化有所影响[8]。

有研究表明visfatin启动子多态性与急性炎症损伤及慢性轻度炎症反应都有所关联[9，10]。rs61330082单核苷酸多态性位于visfatin远端的启动子区域，包含了多个CAAT盒和TATA样序列以及CCAAT/NF-1，NF-B，NF-IL-6，GR和AP-1的结合位点，并与visfatin基因表达和血清脂质水平的调节相关[11～13]。在Ooi等的研究中，发现visfatin及其遗传变异体的表达水平在儿童中与肥胖相关及不良心脏代谢的参数有关，如甘油三酯及严重的高血压等，证明了visfatin在心血管代谢性疾病领域的重要作用[14]。接着他们的团队进一步在分子水平体外实验中对上述结论进行了补充研究，证明了在肥胖儿童中，在visfatin上游启动子区域的 rs11977021及 rs61330082的调节下，可提高体外转录的活性，进而影响下游蛋白的水平及个体表型[15]。上述研究阐述了内脂素visfatin及其遗传变异体在血脂水平及炎症通路中的调节作用，并暗示其表达水平及基因多态性可能与动脉粥样硬化性血管疾病的易感性相关。据我们所知，目前尚未发表有关rs61330082多态性与IS发病风险之间关系的研究，本篇文章旨在探索rs61330082多态性与缺血性卒中的发病风险的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象 本研究纳入了年龄、性别相匹配的368例患者和381例健康对照。我们收集了从2011年9月至2012年9月在中国医科大学附属第一医院神经内科住院的患者，根据神经系统检查和影像学资料，将首次诊断为急性缺血性卒中的患者定义为符合纳入条件的病例组。而短暂性缺血性发作，脑栓塞，脑外伤，脑血管畸形，凝血功能异常，自身免疫性疾病，肿瘤和慢性感染疾病的患者均被排除在外。另外，我们选择了来自红十字会医院未见卒中及其他神经系统疾病的体检者作为对照组。所有受试者均来自生活在中国北方的汉族人群。两家医院的伦理委员会均批准了本项研究，且所有参与者均签署了书面知情同意书。病例组和对照组的临床记录，包括一般状况(如性别，年龄，种族，吸烟和饮酒史)，既往史，家族史，血压，空腹血糖，血清甘油三酸酯(TG)和总胆固醇(TC)。此外，患者还需要行头部CT或MRI，超声心动图，颈动脉超声，经颅多普勒检查和心电图检查。高脂血症定义为血浆总胆固醇水平>5.72 mmol/L和(或)血浆甘油三酸酯水平> 1.7 mmol/L，或有降血脂药物治疗史。

1.2 DNA提取和基因分型 采用DNA纯化试剂盒(Promega，Madison，USA)提取200 μL EDTA抗凝外周血的基因组DNA，并用分光光度法测量DNA纯度，并将DNA样品置于-80℃冰箱中保存。使用聚合酶链反应-连接检测反应(PCR-LDR)方法对基因组DNA进行基因分型。表1列出了用于PCR的引物序列。PCR扩增体系的总体积为10 μl，包括1×GC-I缓冲液(Takara)，3.0 mmol/L Mg2+，0.3 mmol/L dNTP，1 U热启动Taq聚合酶(Qiagen Inc)，1 μl基因组DNA和每个对应的1 μl引物。循环参数如下：95 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，65 ℃退火40 s，72℃延伸90 s，共11个循环；在94 ℃下持续20 s，59 ℃下持续30 s，72 ℃下持续90 s，共24个循环；最后在72 ℃下延伸2 min。LDR的探针在表1中列出。每个PCR产物的连接检测反应的体积为10 μl，其中包含1 μl 10×连接缓冲液，2 μl PCR产物，6 μl双蒸馏水，0.4 μl每个区分探针和0.25 μl Taq DNA连接酶(New England Biolabs，USA)。LDR参数如下：94 ℃ 60 s，56 ℃ min，共38个循环。反应后，将5 μl LDR反应产物与9 μl Hi-Di ROX(Applied Biosystems，USA)及0.5 μl的上样缓冲液混合，然后在95 ℃下变性5 min。最后用ABI Prism 3730XL DNA测序仪(Applied Biosystems，USA)分析混合物。

表1 Primer sequences and the probes for LDR

2 结 果

实验组和对照组的基本临床特征见表2。年龄和性别在病例组和对照组分布无明显差异，然而，病例组中患有高血压、糖尿病及高脂血症，以及吸烟者、饮酒者的个体比例显着高于对照组。

表2 病例组与对照组临床资料比较

表3和表4分别列出了病例组和对照组rs61330082的基因型和等位基因频率。SNP rs61330082在病例组及对照组人群中的基因型的频率分布均符合Hardy-Weinberg遗传定律，说明本研究纳入的人群具有群体代表性。(病例组，P=0.630；对照组，P=0.139)。实验组中，AA，AG和GG基因型频率分别为27.99%，48.64%和23.37%，其在对照组中依次为25.99%，46.19%和27.82%。与(AA+AG)相比，GG基因型的个体罹患卒中的风险并没有增加，缺血性卒中的患者同对照组相比，其等位基因分布也没有显着差异(P=0.163)。而分别在男性及女性的卒中患者同对照组进行性别特异性分析中，仍未见明显的统计学差异(P=0.159；P= 0.684)。

表4 男性及女性病例组与对照组rs61330082位点基因型及等位基因频率比较

我们使用Logistic回归模型去计算visfatin基因型与缺血性卒中发病风险之间的相关性(见表5)。即使校正了其他可能的混杂因素，包括年龄，性别，吸烟，饮酒，高血压，糖尿病，高脂血症，仍未在病例组及对照组人群中观察到显著的统计学差异(OR=1.378；95%CI=0.971～1.955；P=0.073)。

表5 rs61330082位点Logistic回归结果

3 讨 论

据我们所知，这是第一篇评估visfatin基因变异体与缺血性卒中发病之间相关性的研究。本研究中，我们未能在中国北方汉族人群中观察到visfatin单核苷酸多态性rs61330082与缺血性卒中间发病存在显著的相关性。此外，当我们根据性别进行亚组分析后，仍未观察到visfatin SNP rs61330082与IS疾病之间存在显著的统计学差异。

Visfatin可能在斑块不稳定过程中发挥作用，而不稳定斑块是缺血性卒中的主要病因之一。Dahl发现visfatin是一种定位于不稳定动脉粥样硬化斑块中泡沫细胞及巨噬细胞内的炎性介质[8]。Visfatin能够诱导内皮细胞中的血管内皮生长因子(VEGF)和基质金属蛋白酶(MMP)的产生[16]，提示其在血管炎症的病理过程中发挥了至关重要的作用。此外，Kim等[17]证明visfatin是一种血管炎性分子，可通过内皮细胞中ROS依赖性NF-κB激活途径来增加炎性因子CAM，ICAM-1和VCAM-1的表达。

Vander等指出[18]，visfatin可以有助于血管平滑肌细胞(SMC)稳定、成熟表型的形成，并可以通过调节烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)生物合成来增加平滑肌细胞生成血管的能力。Leander及其同事证明了在visfatin基因启动子区域中罕见的SNP rs1319501可能与45～60岁女性的首次罹患心肌梗死有关[19]。Wang等提出rs61330082多态性与冠状动脉疾病患者血浆中炎症标志物水平降低有关[20]。在Yan等[21]研究中指出，rs61330082基因多态性与降低发生冠状动脉疾病(CAD)的风险密切相关，尤其是在年轻，男性受试者和非吸烟者中。刘等[22]也有报道指出血浆visfatin水平与CAD显着相关，并独立于其他传统的CAD危险因素。Jin及其团队研究发现，血清visfatin的水平在实验组即冠状动脉钙化患者中，明显高于对照组，证明其与疾病的发展相关，对于其基因多态性rs61330082，其等位基因C(C>T)的频率在中重度患者组中明显高于对照组及轻度患者组，且差异有统计学意义，表明T基因可能对冠脉钙化的患者具有保护作用[23]。因此，我们假设rs61330082多态性可能与缺血性卒中的易感性相关。

在我们的研究中，病例组患糖尿病和高血压以及吸烟者，饮酒者，高血脂个体明显多于对照组，提示吸烟、糖尿病、高血压、饮酒和高血脂为缺血性脑卒中发病的风险因素。rs61330082位点在共显性、显性、隐性和等位基因模型病例组与对照组之间无明显差异，提示visfatin rs61330082多态性与缺血性卒中发病无关。此外，当我们根据性别对患者进行分层分析时，在男性及女性患者组我们仍没有观察到visfatin rs61330082多态性与IS疾病之间的关联。

尽管我们先前的功能性研究证明了visfatin在动脉粥样硬化的发病机制中的重要作用，并且早前的遗传学研究支持visfatin多态性在动脉粥样硬化相关疾病中发挥作用，但我们目前的结果表明visfatin在缺血性卒中中并未起到显著的作用。本研究在中国北方汉族人群中缺乏关联的原因可能有以下几种：(1)缺血性卒中是由不同实体组成的异质性表型，因此CAD和缺血性卒中之间存在遗传效应的差异并不罕见。(2)我们的研究仅在中国北方汉族人群中进行，他们在世界范围内拥有自己独特的基因背景。(3)我们选择的人群的样本量太小，未来更大规模、多种族的研究可能会丰富我们的结果。(4)其他可能的原因可能由于种族、地域的差异，研究设计，检测方法及选择偏倚等。尽管当前研究中提供的数据并不能够表明visfatin rs61330082与IS相关，但在先前的研究中，大量呈现了其与动脉粥样硬化样血管疾病及肥胖、血脂等指标的相关性，因此我们不能完全排除visfatin及其他基因多态性对缺血性脑卒中疾病易感性的潜在影响，而应该多方面考虑并谨慎解释这一结果。

综上，我们的实验证明了rs61330082单核苷酸多态性可能与中国北方汉族人群中缺血性卒中的易感性无关。但是，未来仍需要进行更大范围和种族人群多样化的进一步研究，以更好地了解rs61330082多态性与IS的关联。