外源添加糖及氨基酸对咖啡果皮酒风味和感官品质的影响
2020-08-04胡荣锁甘小红董文江龙宇宙宗迎初众
胡荣锁 甘小红 董文江 龙宇宙 宗迎 初众
摘 要：為探究不同外源添加物对咖啡果皮酒风味和感官品质的影响，本研究添加4种可发酵糖（葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖）和2种可发酵氨基酸（精氨酸和谷氨酸）发酵生产咖啡果皮酒。以顶空固相微萃取-气相质谱法结合感官评价，分析外源添加物对咖啡果皮酒风味和感官品质的影响。结果表明：共检出9大类75种风味组分，以酯类和醇类为主;添加可发酵糖能显著增加咖啡果皮酒醇类组分（23.99%～121.24%），添加可发酵氨基酸咖啡果皮酒能增加酯类组分（25.77%～28.18%），而添加可发酵糖咖啡果皮酒酯类组分显著减少（10.81%～69.94%）;方差齐性检验P=0.206>0.05，在α=0.05的水平上各外源添加物果酒风味组分没有显著性差异，事后两两比较P=（0.371～0.989）>0.05，说明样品间差异不显著，但PCA分析（PC1：96.01%，PC2：3.13%）能将其完全区分;使用模糊数学法感官评判发现，添加精氨酸所酿造的果酒综合得分最高（92.40），更加适合人们的口味，整体风格显著，协调性好，谷氨酸添加次之（80.80），果糖和蔗糖所酿造的咖啡果皮酒综合评分一致（78.20），添加麦芽糖果酒得分最低（74.20）。综上所述，添加氨基酸可改善咖啡果皮酒风味和口感，发酵糖改善效果不如氨基酸。
关键词：外源添加物;咖啡果皮酒;风味;感官品质中图分类号：TS262 文献标识码：A
Influence of Different Exogenous Fermentable Sugars and AminoAcids on Flavor and Sensory Quality of Coffee Pulp Wine
HU Rongsuo1，3，4， GAN Xiaohong2， DONG Wenjiang1，3，4， LONG Yuzhou1，3，4*， ZONG Ying1，3，4， CHU Zhong1，3，4
1. Spice and Beverage Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wanning， Hainan 571533， China; 2. Yangtze Normal University， Chongqing 408100， China; 3. National Center of Important Tropical Crops Engineering and Technology Research， Wanning， Hainan 571533， China; 4. Hainan Provincial Engineering Research Center of Tropical Spice and Beverage Crops， Wanning， Hainan 571533， China
Abstract： To explore the effect of coffee pulp wine flavor and sensory quality via different exogenous additives， coffee pulp wine was made by coffee pulp added fermentable sugars （glucose， fructose， maltose and sucrose） and fermentable amino acids （glutamic and arginine） respectively， and coffee pulp wine flavor and sensory quality on exogenous additives effects was detected by headspace solid phase micro extraction gas chromatography mass spectrometry （HS-SPME-GC/MS） and human sensory analysis. The results showed that a total of 9 categories of 75 flavor components was detected and the main compounds were esters and alcohols. Fermentable sugars could increase the alcohol contents of coffee pulp wine （23.99%–121.24%） significantly， and amino acids could also increase the esters contents （25.77%–28.18%）， while the esters contents of fermented sugars were significantly reduced （10.81%–69.94%）. The homogeneity of variance was tested atP=0.206>0.05， there was no significant difference in flavor components at the level ofα=0.05， meanwhile it indicated that there was no significant difference between the samples by tukey post-hoc tests on one-way analysis of variance [P=（0.371–0.989）>0.05]， nevertheless principal component analysis （PCA， PC1： 96.01%， PC2： 3.13%） could completely distinguish them. The results of sensory evaluation with fuzzy mathematics method showed that the coffee pulp wine brewed with arginine added had the highest comprehensive score （92.40）， which was more suitable for people's taste， and had excellent overall style and preferable coordination， followed by glutamic added coffee pulp wine （80.80）. The comprehensive score of fructose and sucrose was the same （78.20）， and that of maltose was the lowest （74.20）. In summary， amino acids and fermented sugars also could improve the flavor and taste of coffee pulp wines， while the effect of adding fermented sugar was not as good as that of amino acids.
Keywords： additives; coffee pulp wine; flavor; sensory quality
DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.6.020
咖啡是茜草科（Rubiaceae）咖啡属（Coffea）多年生常绿灌木或小乔木，是热带重要的特色经济作物，在我国种植面积为12万hm2，年产鲜果约35万t，鲜果中约45%为果皮[1]。Esquivel等[2]将咖啡果皮定义为咖啡外果皮和咖啡果肉混合物，果皮含有丰富的有机营养物质、17种氨基酸、多种维生素和矿物质[3]，还含有大量的生物活性組分，对慢性疾病有不同的预防和治疗作用[4]，可以作为一种新型的食品原料[5]。咖啡果皮酒是以咖啡果皮为原料发酵生产的新型饮品，由于咖啡果皮是以可溶性膳食纤维、果胶和蛋白质为主[1，3]，本身可利用的发酵糖含量较少，咖啡果皮酒风味组分含量较少，且不持久，所以要外源添加碳源和氮源以利发酵转化。
目前对咖啡果皮酒的研究相对较少，国外未检索到相关文献，国内仅处于发酵工艺和发酵风味研究阶段。例如，刘静等[6]以新鲜咖啡果肉为原料通过正交实验及响应面分析，对其果酒酿造过程的前处理工艺及发酵工艺进行优化，得到良好的实验效果;胡荣锁等[7]为探讨单菌发酵对果酒风味的影响，利用GC-MS分析、电子感官（电子鼻和电子舌）和人为感官判定菌种对咖啡果皮酒整体风味的影响，并筛选到最优的发酵菌种。未检索到咖啡果皮酒外源物质添加研究，但其他类型果酒有报道。例如，Seguinot等[8]研究表明利用氨基酸等作为氮源添加对发酵产生的香气有影响;徐培培[9]报道了用6种不同的初始糖量发酵对鲜食葡萄品种酒液品质的影响研究;谢克林等[10]通过气相色谱-质谱法对添加4种外源可发酵糖的葡萄酒进行挥发性化合物的定性定量分析;Chen等[11]报道了3种芳香氨基酸对荔枝酒挥发性和非挥发物质的影响，发现氨基酸可使酒风味多样化或强化;商玉荟等[12]研究氨基酸添加对荔枝酒发酵动力及品质影响。除了对氨基酸和可发酵糖的研究外，添加其他组分对果酒风味的研究国内外也有报道，如Wilkowska等[13]报道了添加糖苷酶对樱桃酒风味的增强作用;Niu等[14]报道了不同类型橡木对枸杞酒风味和抗氧化活性的促进作用。综上所述，外源添加碳源和氮源能改善发酵酒风味和提升品质。
本研究拟在咖啡果皮酒的酿造过程中，分别添加4种可发酵糖（葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和果糖）和2种氨基酸（谷氨酸和精氨酸），通过改善咖啡果皮酒发酵条件，达到改善咖啡果皮酒风味和品质的目的。此项研究实施可使咖啡果皮酒感官品质得到提升，为咖啡果皮酒的进一步研发和应用提供理论支持。
1 材料与方法
1.1材料
云南小粒种咖啡（Coffea arabicaL.）果皮，由云南农业大学热带作物学院协助收集;纤维素酶为Celluclast 1.5 L，自黑曲霉（Aspergillus niger）中提取，购自诺维信公司（Novozymes）;葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、谷氨酸、精氨酸、麦芽汁培养基、硫酸、亚硫酸氢钠、无水乙醇等均为分析纯，正构烷烃（C7～C30）购自美国Supelco公司，3-辛醇标准品购自美国sigma公司。7890A-5975C气相色谱质谱联用仪，美国Agilent公司;HS-100型自动进样器，瑞士CTC公司。
1.2方法
1.2.1 样品制备方法 按胡荣锁[7]前期实验方法制备咖啡果皮酒。可发酵糖是分别添加葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和果糖，使发酵液初始糖度达到15.00 °Brix，不添加氨基酸;氨基酸添加是使用蔗糖将发酵液糖度调整为15.00° Brix，谷氨酸和精氨酸添加量分别为0.10 g/100mL，每种添加物做3个平行，加入样品中进行28 ℃ 120 r/min摇床发酵4 d。发酵完成后用细纱布将酒液过滤，过滤后的酒液倒入已杀菌准备好的瓶子中，尽量装满，密封，巴氏杀菌后保存在阴凉干燥处。
1.2.2 咖啡果皮酒香气成分检测[7]SPME前处理：取2 mL发酵好的咖啡果皮酒（按0.3 g/mL加氯化钠），放入20 mL的顶空瓶中，50 ℃下预热20 min，插入萃取头吸附30 min，将萃取头插入气相色谱进样口，250 ℃解吸附5 min。气质条件：进样口温度为250 ℃，柱初始温度为50 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升温至240 ℃，再以1 ℃/min升温至250 ℃。载气为氦气，流量为1.0 mL/min，不分流进样，进样量为1 μL。色谱柱：DB-5MS（30.0 m×250.0 μm×0.25 μm）。离子源为EI源模式，电子轰击能量为70 eV，离子源温度为230 ℃，接口温度为280 ℃，扫描范围为30～350 amu。色谱库NIST14。
1.2.3 化合物定性定量方法 定性方法[15]：未知化合物定性通过以下2种方法：质谱解析后与NIST14标准谱库比对;计算待定化合物线性保留指数（linear retention index），不确定化合物通过与参考文献中保留指数比对。线性保留指数使用正构烷烃（C7～C30）标定，计算公式如下：
式中：LRI表示线性保留指数;tx表示待定性化合物的保留时间;tn、tn+1分别表示组分具有n和n+1个碳原子的正构烷烃保留时间，其中tn+1>tx>tn。
定量方法[16]：使用3-辛醇外标半定量法，默认每个化合物对3-辛醇的相对响应因子为1，为计算准确使用二氯甲烷为溶剂做3-辛醇标准曲线，得出标准曲线R2=0.9938，表示曲线拟合良好，公式如下：
式中：y表示化合物浓度，mg/L;x表示化合物峰面积。
1.2.4 咖啡果皮酒感官检测方法 在咖啡果皮酒酿制过程中添加6种外源添加物分别做3个平行，酿制完成后，在明亮自然光温度适宜的房间组织10人的品尝小组，小组成员为自由组合，无性别、年龄、文化程度、籍贯等限制，通过用口、眼、鼻等感觉器官检查咖啡果皮酒的感官特性，对咖啡果皮酒进行品尝评分，评分标准见表1。
采取密码标记后进行感官品评，将酒倒入品尝杯中，酒在杯中的高度为1/4～1/3，约10 mL，每位成员分别对本实验所酿制的18种咖啡果皮酒的外观、香气、酒味、甜味、酸味5项指标进行品尝[8-9]，根据感官指标进行综合分析打分。满分100份，得分50分为差，70分为较好，90分为良好，得分记入咖啡果皮酒品尝评分表中。
1.3数据处理
本研究色差数据以平均值±标准差的形式表示，每组数据重复3次;为了验证各外源添加样品间变异是否显著，采用ANOVA方法检测多组样本是否具有相同的总体均值（P<0.05），文中所有分析数据为各组处理重复的平均值，利用Microsoft Excel 2010进行统计处理，SPSS 21.0进行方差分析，各平均值利用Duncan多重比较进行差异显著性分析（P<0.05），绘图软件为Origin 2018 64bit。应用Unscramble 9.7（CAMO Software AS， Norway）對果酒酯类和醇类挥发性化合物的半定量数据进行主成分分析（Principal Component Analysis， PCA）。
2 结果与分析
2.1外源添加咖啡果皮酒风味组分分析
外源添加咖啡果皮酒样品GC-MS扫描后离子色谱图见图1，化合物采用与NIST14质谱库和NIST MS Search 2.2检索对比来鉴定，并使用正构烷烃校正，以确定其化学组成。将不同外源添加咖啡果皮酒平行样品比较分析，减少误差，提高结果的准确性与可信度，并对检测到的风味组分用3-辛醇半定量，得到结果见表2。
蔗糖是最常见的可发酵糖之一，在酒类发酵过程中被大量使用[6，17-19]，本研究前期实验也是以蔗糖为发酵糖[7]。为便于分析，将蔗糖发酵果酒作为参考进行比较。从6种外源添加物发酵液挥发性风味物质总离子流图谱可以看出（图1），蔗糖咖啡果皮酒中的挥发性风味物质比较丰富，风味物质挥发时间集中在15～38 min，在峰高、峰面积上有较明显变化，挥发性成分没有显著差异。对比几种不同添加物的咖啡果皮酒，精氨酸咖啡果皮酒的风味物质最丰富，整体感觉最佳。
6种外源添加物咖啡果皮酒检出化合物75种（表2），主要包括醇类24种、酯类23种、酸类9种、酮类5种、萜烯类2种、醛类3种、烷类1种、酚类4种和4种其他化合物，共同拥有化合物50种，其含量占化合物总含量的94.55%～ 98.84%（96.77±1.51），可见不同的外源添加物会对咖啡果皮酒的风味造成一定的影响。
化合物类别分析见图2，由图可知醇类化合物是果酒中最主要的挥发性成分，主要由酵母代谢和糖苷与酯的水解作用形成[20]，共鉴别出24种，占总挥发性风味物质的39.87%～70.19%（58.12± 11.05），含量较多的化合物分别为乙醇、异戊醇和苯乙醇，其中各外源添加物果酒乙醇含量差异显著（P<0.05），可以看出不同外源糖由于糖苷的不同对醇类的影响较大（57.09±14.09），而精氨酸和谷氨酸添加会显著促进乙醇的产生[21][外源糖（42.28±28.75），外源氨基酸（106.47±4.57）]，且不同氨基酸对醇类的影响作用不同。总醇的含量大小依次为谷氨酸组（357.95 mg/L）>精氨酸组（356.96 mg/L）>果糖组（282.16 mg/L）>麦芽糖组（276.04 mg/L）>蔗糖组（200.60 mg/L）>葡萄糖组（161.76 mg/L），该结论除氨基酸外，可发酵糖果酒酒样醇类含量的顺序与谢克林等[10]的报道一致，但本研究醇类含量则比上述研究高。
酯类化合物是构成果酒香气的重要组成部分，对酒的主体香型及风格具有重要的影响，它们赋予果酒果香和花香的感官特性。共检出酯类化合物23种，占总挥发性风味物质的11.23%～ 33.62%（27.14±9.80），主要为山梨酸乙酯和4-己烯酸乙酯（其他同分异构体），氨基酸对酯类的形成也有促进作用。总酯含量大小依次为谷氨酸组（188.36 mg/L）>精氨酸组（184.82 mg/L）>葡萄糖组（146.95 mg/L）>蔗糖组（131.07 mg/L）>果糖组（80.15 mg/L）>麦芽糖组（44.18 mg/L）。由于酯类主要由原料和酵母代谢过程产生，所以氨基酸可促进酯类组分含量的形成，且不同可发酵糖对酵母代谢酯类组分含量影响显著[10]。
酸类化合物是在酒精发酵过程中酶促反应形成的，对酒体起到一定呈味助香的作用，能形成水果、奶酪、脂肪及腐败味的气息，因此酸类组分是酒体中不可或缺的，但含量过高会有负面影响。在本实验中共检出酸类组分9种，其含量占总挥发性组分的5.69%～17.60%（11.79±4.84），其中主要的2种酸为辛酸和（E）-3-乙烯酸。总酸含量大小依次为葡萄糖组（71.42 mg/L）>麦芽糖组（62.77 mg/L）>谷氨酸组（51.13 mg/L）>蔗糖组（47.53 mg/L）>果糖组（45.73 mg/L）>精氨酸组（33.19 mg/L）。
醇类、酯类和酸类化合物组分是构成果酒风味的主要组分，本实验中3类组分占挥发性组分总含量的93.68%～98.69%（97.05±1.83）。发酵的酒体中还发现了萜烯类化合物，其在酒中是功能性化合物，具有抗菌活性、抗氧化活性等功效[22]。在6种外源添加果酒酒样中均检出雪松烯，含量在0.20～0.86 mg/L，仅在葡萄糖和蔗糖的果酒酒样中发现了α-蒎烯，质量浓度分别为1.41、0.17 mg/L。
2.2差异性分析
以不同外源添加检测的风味组分为基础进行单因素方差分析，所得的结果见表3。方差齐性检验结果，从显著性概率看，P=0.206>0.05，说明各外源添加的方差在α=0.05的水平上没有显著性差异，即方差具有齐整性。使用LSD法对样品进行事后两两比较，在显著水平0.05下，样品间P=（0.371～0.989）>0.05，说明样品间差异不显著（表4）。
醇类和酯类是咖啡果皮酒风味的主体组分，以醇类和酯类组分进行PCA分析，主成分分析图见图3，化合物和添加组分编号见表2，可以看出虽然样品间差异不显著，但主成分仍能将其较好的区分，累积贡献率为98%>85%，属于有效提取，基本上表达了样品的全部信息。
由圖3可以看出，以PC1为基准大致分为3组，谷氨酸和精氨酸一组，果糖和麦芽糖一组，蔗糖和葡萄糖一组;以PC2为基准，可分为3组，果糖组、麦芽糖组、其余4种一组。精氨酸和谷氨酸位于第1象限，与其相关为7种醇类和12种酯类化合物;
蔗糖和葡萄糖位于第2象限，与之相对应的为6种醇类和8种酯类化合物;麦芽糖位于第3象限，与之相对应的为5种醇类和2种酯类;果糖位于第4象限，与之相对应的为6种醇类和1种酯类，这可能是由于不同糖和氨基酸对酵母代谢造成了不同的影响，使果酒风味多样化。
2.3不同种类添加物对发酵咖啡果皮酒感官分析
外源添加酿造咖啡果皮酒色度结果见表5，
葡萄糖咖啡果皮酒明亮度最高（38.64）更加的澄清透明，精氨酸咖啡果皮酒明亮度（36.32）则相对欠缺，葡萄糖咖啡果皮酒与其他几种果酒色泽明亮度差异显著（P<0.05，n=3）。精氨酸咖啡果皮酒红色度最高（2.26），葡萄糖红色度最低（0.59）。谷氨酸果酒的黄色度和彩度方面都高于其他几种果酒，与精氨酸咖啡果皮酒无明显差异。综上所述，添加精氨酸酿造的咖啡果皮酒比其他几种色泽更加浓郁。
2.4不同外源添加物对发酵咖啡果皮酒感官分析
对食品感官质量进行模糊数学法评判时，权重的分配方案会直接影响最后评价结果的正确性。权重集表示各评价因素权重系数的集合。每个评价因素对应一个权重系数，通常用A表示。本实验采用强制决定法确定咖啡果皮酒各感官指标权重[23]，A={A外观，A香气，A酒味，A甜味，A酸味}= {0.20， 0.30， 0.20， 0.20， 0.10}。
将表6中的6种咖啡果皮酒感官因素的各等级评价人数分别除以总评价人数，得到模糊矩阵R。由表6可得：以编号为1的蔗糖咖啡果皮酒为例，即建立外观、香气、酒味、甜味和酸味，5个单因素的模糊评价矩阵：U外观=[0.70 0.30 0.00]，U香气=[0.50 0.50 0.00]，U酒味=[0.40 0.40 0.20]，U甜味=[0.50 0.20 0.30]，U酸味=[0.50 0.40 0.10]。将上述对1号样品的5个单因素评价结果写成一个模糊矩阵。
即Y1=（0.52，0.37，0.11）。同理，可得其他几组样品的模糊评价结果。好、中、差3个等级分别赋值为90、70、50。将Y中的各个量乘以相对应的分值，再加和，得到最后感官评价值。
表7为添加5种不同添加物的感官评价表，添加精氨酸所酿造的果酒综合得分最高，更加适合人们的口味，整体风格显著，协调性好。添加麦芽糖果酒得分最低，总体得分和排名低于其他几种物质，添加果糖和蔗糖所酿造的咖啡果皮酒综合评分一致，说明两者口感很接近，几乎没什么区别。其中，精氨酸所酿造的果酒在酒味指标上明显高于其他果酒，酒香更加的浓郁。添加谷氨酸的果酒在外观上有明显优势，添加果糖与蔗糖的果酒在甜味上存在极大的优势。简而言之，不同的添加物都有优势与不足，为后续研究混合添加发酵奠定基础。
3 讨论
分别添加4种可发酵糖（葡萄糖、果糖、麦芽糖和蔗糖）和2种可发酵氨基酸（精氨酸和谷氨酸）发酵生产的咖啡果皮酒，经过检测发现75种风味组分，共有组分50种，可见添加不同外源使咖啡果皮酒的风味多样化，这一结论与徐培培[9]、谢克林等[10]的文献一致。醇类和酯类同样是咖啡果皮酒的主体组分，添加氨基酸能增加醇类和酯类组分，商玉荟等[12]、Chen等[11]的研究也表现出同样的结论，可见添加外源糖和氨基酸能改善并强化咖啡果皮酒的风味。4种糖发酵果酒的醇酯结构不同，不同糖添加具有风味各异的类型[10]，但感官评价得分相差不显著，因此4种可发酵糖均可用来作为发酵原料，但从其风味类型和经济指标来看，今后实验原料仍以蔗糖作为可发酵糖。
通过模糊数学法评判咖啡果皮酒风味时，添加精氨酸所酿造的果酒综合得分最高，更加适合人们的口味，整体风格显著，协调性好，谷氨酸次之。氨基酸添加效果高于可发酵糖，其原因应该是添加氨基酸增加了氮源，促进了发酵的进行，虽然果酒中风味组分中含氮组分较少，但酵母菌增殖需要适当地增加氮源组分[24]。由此可知現有发酵体系中碳氮比失衡，氮源的缺失并未使酿酒酵母的发酵能力达到最佳[25]，特别是乙醇的生产能力[26]，添加氨基酸组乙醇含量普遍高于未添加组。本研究中精氨酸和谷氨酸添加组风味组分种类和含量不存在显著性差异，但两者感官得分相差明显，可见发酵菌群对氮源也有一定的选择性[27]，最佳氮源的添加种类和含量需要进一步验证。
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