辣木的染色体制片优化及核型分析

陈盈盈 官锦燕 谭嘉娜 罗剑飘 黄海英 文明富 罗青文

摘  要：以辣木分生组织为材料，采用酶解去壁低渗法制片，探讨不同取材部位、预处理方式和酶解时间对辣木染色体制片的影响，并对其进行核型分析，以期为辣木的起源、演化及遗传育种提供一定理论依据。结果表明：以辣木新枝茎尖为最佳取材部位，用饱和对二氯苯预处理2 h，再用4%纤维素酶和5%果胶酶混合物酶解4 h，制片所得染色体效果最佳。核型分析表明，辣木染色体属于小染色体，有28条，核型公式为2n=2x=2n=28m，属于1B类型，核型不对称系数60.29%，核型对称程度较高，这表明辣木在进化中可能处于比较原始类型。

关键词：辣木;染色体制片;核型分析;茎尖中图分类号：Q943.2;S31      文献标识码：A

Optimization of Chromosome Sectioning and Karyotype Analysis ofMoringa oleifera

CHEN Yingying， GUAN Jinyan， TAN Jiana， LUO Jianpiao， HUANG Haiying， WEN Mingfu， LUO Qingwen^*

Guangdong Bioengineering Institute （Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute） / Guangdong Key Laboratory of Sugarcane Improvement and Biorefinery， Guangzhou， Guangdong 510316， China

Abstract： Chromosome mounting technique was optimized to explore the chromosome karyotype of Moringa oleifera， to provide important cytological evidences for the study of the evolution， evolutionary characteristics and genetic regularity of camphor plants. The effects of different sampling position， pretreatment methods and enzymatic hydrolysis time on the production ofM. oleiferawere discussed by the enzymatic dissociation wall low permeability method， microscope observation and photography. The observation showed that the best sampling position was the tips of new branches. Samples pretreated in p-dichlorobenzene for 2 h， dissociated in 4% cellulase and 5% pectinase for 4 h could achieve the optimal experimental results. Karyotype analysis showed that the chromosome number was 28， and the karyotype formula was 2n=2x=2n=28m. The results demonstrated that the asymmetry indexes was 60.29%， and the karyotype was 1B type， suggesting thatM. oleiferawas possibly relatively primitive in the evolution.

Keywords： Moringa oleifera; chromosome sectioning; karyotype analysis; stem tip

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.015

辣木（Moringa oleifera Lam），又稱鼓槌树，属辣木科（Moringaceae）辣木属（Moringa）多年生乔木，原产于印度和非洲，辣木科仅有1属14种[1^-2]。辣木含有丰富的纤维、维生素、矿物质、蛋白质、氨基酸、多糖、辣木素、皂苷、酚类和活性酶类等成分，具有消炎、抑菌、降血糖、降胆固醇、凝血、抗氧化、抗肿瘤和癌症等功能[3-4]。因此，辣木又被誉为“神奇之树”和“母亲最好的朋友”。很多发展中国家利用辣木来改善儿童营养不良，辣木具有食用、园林造景、工业、药用等多种用途[5]。

染色体核型分析技术能明确识别各个染色体的特征，有助于基因定位的研究，它是细胞遗传学的一项基本技术，也是染色体工程、细胞分类学和植物育种学一个不可缺少的手段[6-7]。目前，辣木细胞学上的研究仅局限于辣木染色体数量和倍性的研究。Puri等[8]以印度多油辣木材料的小孢子发育，观察到二倍体染色体数2n=28;张洁等[9]以多油辣木栽培品种‘PKM1的茎尖为材料，同样得出二倍体染色体数2n=28;Mendioro等[10]以花蕾为材料，也得出二倍体染色体数2n=28;魏静[1^1]和向素琼等[1^2]均以辣木茎尖为材料，均确定辣木为二倍体，染色体数2n=28，初步得出染色体长度和染色体组总长度。但最后均未能得到臂比、着丝点位置、核型的不对称程度和核型公式等核型指标，进而进行核型分析。至今，有关辣木染色体核型分析的研究未见报道。为此，本研究对辣木染色体制片技术进一步优化，并进行核型分析研究，摸索出成熟的辣木染色体制片技术，得出辣木的核型公式和不对称程度，为辣木的起源、演化及遗传育种提供一定的理论依据和技术基础。

1  材料与方法

1.1 材料

实验材料为印度辣木的茎尖和嫩叶，采自广东省生物工程研究所湛江甘蔗研究中心实验基地。

1.2  方法

1.2.1  取材和预处理  于上午9∶00—11∶00取健壮的新枝茎尖，长度小于3 mm的幼叶（以下简称小叶）以及长度在3～8 mm幼叶（以下简称大叶），分别置于0.002 mol/L 8-羟基喹啉处理2 h。清水冲洗后转入卡诺固定液[无水乙醇-冰乙酸（3∶1，V/ V）]，固定24 h，再用70%乙醇4 ℃冰箱保存备用。

2.5

方法，进行预处理梯度实验。清水冲洗后转入卡诺固定液[无水乙醇-冰乙酸（3∶1，V/V）]，固定24 h，70%乙醇4 ℃冰箱保存备用。

1.2.2  染色体标本制备  染色体标本制备采用酶解去壁低渗法^[13-14]，具体步骤参照官锦燕^[15]。

（1）先把材料置于蒸馏水前低渗30 min;（2）再置于5%纤维素酶和4%果胶酶混合液中，在37 ℃中酶解2、3、4、5 h;（3）吸取酶液，加入蒸馏水后低渗30 min;（4）吸取蒸馏水，滴加临时配制的固定液[3（乙醇）∶1（冰乙酸）]后固定15 min;（5）涂片，载玻片上先滴3滴固定液，夹取少量茎尖组织或叶片边缘组织，迅速涂抹在载玻片上，且在火焰上迅速烘烤;（6）染色，用吉姆萨染色15 min，冲洗玻片干燥后再镜检。

1.2.3  核型分析  用POTIKA正立显微镜观察，Optika Vision pro拍照系统拍照，在40×物镜下对单位视野面积内处于分裂中期的细胞进行计数^[16]。选择30个染色体分散且形态较好的细胞进行染色体数目统计，选取5个染色体形态清晰且无重叠的细胞用Photoshop图像软件进行核型分析。核型分析方法根据李懋学等^[17]的标准，染色体形态依据Levan等^[18]的方法归类，核型对称性按Stebbins^[19]的标准划分。

臂比（r）=长臂（S）/短臂（L）

染色体相对长度=染色体长度/染色体组总度×100%

染色体相对长度系数（I. R. L）=每条染色体相对长度/染色体平均相对长度

平均长度核型不对称系数（As. k）=长臂总长/全组染色体总长×100%

2  结果与分析

2.1辣木染色体制片技术优化

2.1.1  不同取材部位对中期细胞比率和形态的影响  从表2可知，不同取材部位对中期细胞数目和形态的影响均较大。3种材料中期细胞所占比率分别为茎尖22.6%、小叶14.3%、大叶5.4%;适合核型分析的中期细胞比率为茎尖18.2%、小叶7.8%、大叶1.3%。由此可见，茎尖所含的中期细胞比率明显大于小叶和大叶的。由于茎尖是分生组织，新陈代谢快，细胞活动最活跃，中期分裂相最多;小叶边缘组织的新陈代谢又比大叶的快，分裂相也明显比大叶多。从中期細胞的形细胞小，细胞质厚，染色体不分散态来看，茎尖细胞大，细胞质稀薄，背景干净，且染色体也较分散，更有利于细胞的核型分析。结合中期细胞的数量和细胞形态可判断，茎尖可作为最佳的取材部位，辣木全年生长，新枝茎尖多，取材方便。

2.1.2  不同预处理方法对染色体制片效果的影响  6种不同预处理方法对辣木茎尖处理的结果（图1，表3）表明，不同预处理方法对中期细胞数目，染色体分散效果及清晰度都有一定的影响。饱和对二氯苯比8-羟基喹啉所得的中期细胞比率要高，饱和对二氯苯处理2 h的中期细胞比率为24.5%，明显高于其他处理组（表3）。其相对应的处理效果也最好（表3，图1B2），染色体分散，聚缩，形态清晰，可见溢痕，很适合染色体核型分析。其次是8-羟基喹啉预处理2.5 h（图1A2），染色体分散，聚缩，形态清晰。而饱和对二氯苯处理1.5、3 h和8-羟基喹啉处理2、3 h（图1A1，图1A3，图1B1，图1B3），效果均不理想，染色体形态较模糊，不利于核型分析。

2.1.3  不同酶解时间对染色体制片效果的影响  从不同酶解时间对制片效果的影响可知（表4），酶解时间对染色体分散效果及清晰度影响较大，特别是细胞背景的干净程度。最适合的酶解时间是4 h，此时细胞背景干净，染色体分散性良好，形态清晰，最适合核型分析。酶解2、3 h的细胞背景和染色体形态不够理想;酶解5 h细胞极易破裂，造成染色体丢失。

2.2辣木核型分析

2.2.1  染色体数目  辣木染色体数目为2n=28，为二倍体。

2.2.2  核型特征  辣木核型分析参数（表5）和染色体核型图（图2）分析结果表明：辣木核型公式为2x=2n=28=28m，全部为中部着丝粒染色体（m），未发现有随体。染色体绝对总长为22.9 μm，绝对长度范围1.098～3.3 μm，属于小型染色体。染色体相对长度为3.96～14.35%，相对长度组成为2n=28=8L+2M₂+6M₁+12S;最长与最短染色体长度比值为3.62，臂比值范围为1.27～1.66，没有臂比大于2的染色体，核型不对称系数为60.29%，核型类型属于1B型。