茶树花Cu/Zn-SOD酶活性及其基因表达分析

王梦馨 吴国火 崔林 韩宝瑜

摘  要：為研究Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段、不同品种间的表达规律以及Cu/Zn-SOD基因表达量与酶活性之间的关系，本研究将‘龙井43品种茶树花分为4个发育阶段，选择15个品种的茶树花为研究对象，采用实时荧光定量PCR技术对3个Cu/Zn-SOD基因表达水平进行定量分析，同时测定Cu/Zn-SOD酶活性。结果表明：在茶树花的4个发育阶段中，第4阶段Cu/Zn-SOD酶活性最低，与其他3个阶段具有显著差异;不同品种的茶树花Cu/Zn-SOD酶活性有较大差异，其中‘紫鹃茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高，其次是‘黄金芽和‘白叶1号，‘黄观音的Cu/Zn-SOD酶活性最低。茶树花不同发育阶段中Cu/Zn-SOD基因表达水平存在较大差异，细胞质型Cu/Zn-SOD1基因表达水平远高于叶绿体型Cu/Zn-SOD2和过氧化物酶体Cu/Zn-SOD3;不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因表达水平有较大差异，Cu/Zn-SOD1基因在‘黄牡丹茶树花中表达量最高，Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号和‘黄观音茶树花中表达量最高，Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃茶树花中的表达量最高。相关性分析得知‘龙井43茶树花不同发育阶段Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD基因表达量之间的相关性不明显，而不同品种茶树花的Cu/Zn-SOD酶活性与Cu/Zn-SOD3基因表达量存在显著相关性。本研究初步明确了Cu/Zn-SOD酶活性较高的茶树品种和茶树花适宜的采摘时间，为茶树花SOD进一步研究提供参考。

关键词：茶树花;Cu/Zn-SOD基因;实时荧光定量PCR;Cu/Zn-SOD酶活性;‘龙井43中图分类号：S571.1      文献标识码：A

Enzyme Activity Characteristics and Expression ofCu/Zn-SODGene in Tea Flowers

WANG Mengxin， WU Guohuo， CUI Lin， HAN Baoyu^*

College of Life Sciences， China Metrology University / Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine， Hangzhou， Zhejiang 310018， China

Abstract：In order to study the expression characteristics ofCu/Zn-SODgene in the flowers within different developmental stages and various cultivars of tea plant flowers， and to discuss the correlationship between the expression ofCu/Zn-SODgene and its enzyme activity， four developmental stages of cultivar ‘Longjing 43 tea flower and 15 tea plant cultivars of fresh flowers were studied. The expression of threeCu/Zn-SODgenes was quantitatively analyzed by real-time fluorescent quantitative PCR techniques， and the enzyme activity of the three Cu/Zn-SOD was also determined simultaneously. The lowest Cu/Zn-SOD enzyme specific activity was found in the fourth stage， and the difference was significant when compared with the other developmental stages. The specific activity of Cu/Zn-SOD enzyme in different cultivars of tea flowers was significantly different. The Cu/Zn-SOD enzyme specific activity of ‘Zijuan tea flower was the highest， followed by ‘Huangjinya and ‘Baiye 1. The activity of Cu/Zn-SOD enzyme of ‘Huangguanyin tea flower was the lowest. The expression level ofCu/Zn-SODdiffered among the developmental stages， and the expression of cytoplasmicCu/Zn-SOD1gene was much higher than those of chloroplast typeCu/Zn-SOD2and peroxisomeCu/Zn-SOD3. The expression ofCu/Zn-SODin different cultivars was significantly different.Cu/Zn-SOD1had the highest expression in cultivar ‘Huangmudan tea flower，Cu/Zn-SOD2gene had the highest expression in cultivars ‘Baiye 1 and ‘Huangguanyin tea flowers， andCu/Zn-SOD3gene had the highest expression in cultivar ‘Zijaun tea flowers. The result of correlation analysis showed that the specific activity of Cu/Zn-SOD had no correlation withCu/Zn-SOD gene expression in different developmental stages of ‘Longjing 43 tea flowers， but had considerable correlation withCu/Zn-SOD3 gene expression in different tea cultivars. In this study， both tea cultivars and suitable plucking stage with high Cu/Zn-SOD activity were preliminarily expounded， which would provide references for the further research on SOD.

Keywords： tea plant flowers;Cu/Zn-SODgene; real time fluorescence quantitative PCR; Cu/Zn-SOD enzyme activity; cultivar ‘Longjing 43

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.06.014

茶树花是茶树（Camellia sinensis（L.） O. Kuntze）的有性生殖器官^[1]，含有丰富的蛋白质、氨基酸、香精油、茶多糖、维生素等营养和功能成分及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等活性物质^[2-6]，对人体具有解毒、降脂、降糖、保护肠胃、增强免疫力和抗氧化等功效^[7-8]。2013年卫生部第1号文件批准茶树花为新资源食品，允许直接开发和利用。研究发现茶树花含有抗氧化活性物质，有较强抗氧化功能，可与抗氧化植物迷迭香相媲美^[9]，其中SOD酶起重要作用^[10]。SOD酶是一种生物内源性抗氧化剂，可通过歧化作用清除体内超氧阴离子自由基，减轻对细胞的损伤，在维持细胞膜的结构和功能中起着十分关键的作用^[11]，其研究已深入到食品、医药、化妆品等领域，应用范围广泛。根据金属辅因子的不同SOD酶可分为3类，即Cu/Zn-SOD、Mn-SOD和Fe-SOD^[12]。Cu/Zn-SOD酶是SOD结构的第一族，在SOD酶中比例最大，占SOD总量86%^[13]。一般植物来源的SOD为Cu/Zn-SOD，包括细胞质型、叶绿体型及过氧化物酶体型3个类型^[14]，其在活性氧清除的酶系中尤为重要，与植物的抗寒、耐盐碱等多种抗逆性关系密切^[15-16]，且植物源SOD有利于人体吸收，使用安全性高，对社会和经济效益明显，市场前景广阔。目前有关茶树中超氧化物歧化酶的研究主要集中于SOD酶在逆境胁迫中的作用^[17-18]，对茶树花中超氧化物歧化酶的研究主要在SOD酶抗氧化、提取工艺方面^[19-20]，对SOD酶活及其基因表达的报道较少。

本研究采用实时荧光定量PCR技术，对上述3类Cu/Zn-SOD基因在‘龙井43品种茶树花不同发育阶段中和15个栽培品种茶树花表达水平做定量分析，同时测定Cu/Zn-SOD酶活性，以探明3类Cu/Zn-SOD基因在茶树花不同发育阶段之间、茶树品种之间的表达差异，解析Cu/Zn-SOD基因表达水平与Cu/Zn-SOD酶活性之间的关系，以初步明确茶树花适宜采摘时间和Cu/Zn-SOD基因表达量高的茶树花品种，为茶树花SOD酶的研发提供参考。

1  材料与方法

1.1 材料

2017年11月于中国计量大学试验茶园（30°19?29.90? N，120°21?19.16? E，海拔11 m）中，参照刘晶晶等^[21]方法采摘5年生的‘龙井43品种茶树上4个不同发育阶段的花（第1阶段：花瓣露白，第2阶段：花瓣初绽，第3阶段：完全绽放，第4阶段：花瓣开败）以及另外14个国家级茶树良种5年生茶树上第3阶段的花（图1）。液氮速冻后，置于?80 ℃冰箱中保存备用。

1.2方法

1.2.1  Cu/Zn-SOD酶活性的测定  准确称取样品0.25 g，加入1 mL预冷的匀浆介质（pH 7.4，0.01 mol/L Tris-HCl，0.0001 mol/L EDTA-2Na，0.01 mol/L蔗糖，0.8% NaCl），冰浴条件下进行匀浆，制成20%的匀浆液，3500 r/min，离心10 min，取上清液待测。采用南京建成生物工程研究所提供的黄嘌呤氧化酶法（植物铜锌超氧化物歧化酶测试盒A001-4）测定样品Cu/Zn-SOD酶活性。每毫克植物组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量定义为1个SOD活力單位（U）。

1.2.2  总RNA提取及cDNA合成  参照天根RNAprep Pure Plant Plus Kit试剂盒操作方法提取各样品总RNA，测得RNA浓度及A₂₆₀/A₂₈₀值在1.8～2.0之间。RNA的完整性通过1%琼脂糖凝胶电泳检测，提取的总RNA有明显的28S和18S两条带，亮度比例大致为2∶1左右，且无拖尾现象，说明所提取的总RNA完整。按照PrimSctipt^TM RT Reagent Kit （Perfect Real Time） 操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第1链。获得的cDNA产物直接用于PCR或–20 ℃贮藏备用。

1.2.3  实时荧光定量PCR分析  以反转录产物为模板，用基因专一性引物^[22]（表1）进行相关基因的荧光定量分析。实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）选取GAPDH作为内参基因^[23]进行校正。qRT-PCR方法参照SYBR Premix Ex Taq^TM（TaKaRa）试剂盒。总体系20 μL﹕10 μL SYBR Premix Ex Taq（2×）、10 ?mol/L上引物和下引物各0.4 ?L、ROX Reference Dye（50×）0.4 ?L、2 ?L cDNA、加无菌水补足至20 ?L。反应在荧光定量PCR仪（ABI stepone plus）上进行。扩增程序为：95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s， 58 ℃退火25 s，共45个循环，最后从55～95 ℃记录溶解曲线。通过分析溶解曲线，确定扩增产物为单一PCR产物。样品和内参分别重复3次。采用2^-ΔΔCt方法进行基因表达水平分析。

1.3数据处理

采用DPS数据分析软件对试验数据做统计分析，利用Duncans 新复极差法进行显著性分析;采用SPSS 22.0统计分析软件进行Pearson相關性分析。

2  结果与分析

2.1  ‘龙井43茶树花的4个发育阶段及不同品种茶树花Cu/Zn-SOD酶活性的差异分析

在‘龙井43茶树花的4个发育阶段中，Cu/Zn-SOD酶活性具有差异（图2）。随着茶树花的逐渐发育，Cu/Zn-SOD酶活性呈下降趋势。Cu/Zn-SOD酶活性由高到低顺序依次为：第1阶段>第3阶段>第2阶段>第4阶段。第1阶段Cu/Zn-SOD酶活性最高，显著高于第4阶段（P< 0.05），但与第2、第3阶段酶活性差异不显著。

对15个茶树品种茶树花第3发育阶段的酶活性测定中，发现：‘紫鹃（编号15）和‘黄金芽（编号9）茶树花Cu/Zn-SOD酶活性最高，显著高于其他品种茶树花（P<0.05）。其次是‘白叶1号（编号5）、‘中茶108（编号3）和‘龙井43（编号1）。‘黄观音（编号12）茶树花酶活性最低，‘紫鹃酶活性是‘黄观音的2.3倍左右（图3）。

2.2‘龙井43茶树花Cu/Zn-SOD基因表达的变化

在‘龙井43品种茶树花的4个发育阶段中，选择第3发育阶段3个Cu/Zn-SOD基因的表达水平为对照，即1个标准单位，据此分别计算3个Cu/Zn-SOD基因在其他3个发育阶段的相对表达水平。结果发现每个Cu/Zn-SOD基因在‘龙井43茶树花的4个不同发育阶段的表达水平都有较大差别（图4）。其中，Cu/Zn-SOD1基因的表达水平随着茶树花的发育而上调，在第4阶段达到最大值，显著高于其他阶段（P<0.05），是对照的1.2倍左右;Cu/Zn-SOD2基因表达水平呈先下降、后上升、再下降的趋势，在第3阶段达到最大值;Cu/Zn- SOD3基因表达水平呈先上升、后下降的趋势，在第2阶段达到最大值，是对照的1.2倍左右。

茶树花的4个发育阶段中的表达差异：在各个发育阶段中分别选用Cu/Zn-SOD1基因的表达水平为对照，即1个标准单位，据此计算Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn-SOD3基因在第1、2、3、4发育阶段的相对表达水平（图5），发现‘龙井43茶树花的4个发育阶段中Cu/Zn-SOD1基因表达水平最高，均显著高于其他2个基因（P<0.05）;在茶树花第1发育阶段，Cu/Zn-SOD1基因表达水平是Cu/Zn- SOD2基因表达水平的8倍左右，是Cu/Zn-SOD3基因的30倍以上;在茶树花的第2发育阶段，Cu/Zn-SOD1表达水平是Cu/Zn-SOD2的18倍，是Cu/Zn-SOD3的30倍;在茶树花的第3发育阶段，Cu/Zn-SOD1表达水平是Cu/Zn-SOD2、Cu/Zn- SOD3的30倍以上，Cu/Zn-SOD2的是Cu/Zn-SOD3的1.4倍左右;在茶树花的第4发育阶段，Cu/Zn- SOD1的是Cu/Zn-SOD2的40倍，是Cu/Zn-SOD3的80倍以上。

2.3不同品种茶树花Cu/Zn-SOD基因的表达差异分析

在15个茶树品种的茶树花发育的第3阶段中，Cu/Zn-SOD基因的表达水平存在明显差异（图6）。分别以‘龙井43茶树花的3个Cu/Zn-SOD基因的表达水平作为对照。结果显示，Cu/Zn- SOD1基因在‘黄牡丹（编号14）茶树花中表达量最高，是对照的2.4倍左右，与其他品种差异显著（P<0.05）。其次为‘鸠坑早（编号7）和‘紫鹃（编号15），皆显著高于其他品种茶树花（P<0.05），而在‘金观音（编号11）中表达量最低。Cu/Zn-SOD2基因在‘白叶1号（编号5）、‘黄观音（编号12）和‘龙井43（对照，编号1）茶树花中表达量最高，‘金观音（编号11）和‘中茶108（编号3）表达量最低。Cu/Zn-SOD3基因在‘紫鹃（编号15）茶树花中表达量最高，是对照的2倍左右，其次为‘黄金芽‘白叶1号‘紫牡丹‘金观音等，其中‘平阳特早（编号2）表达量最低。

2.4茶树花Cu/Zn-SOD酶活性与基因表达水平的相关性

对15个品种茶树花中每个Cu/Zn-SOD基因表达水平与Cu/Zn-SOD酶活性之间关联度进行相关性分析，发现Cu/Zn-SOD3基因的表达水平与Cu/Zn-SOD酶活性呈显著性相关性（P<0.05），其他2个Cu/Zn-SOD基因的表达水平与Cu/Zn-SOD酶活性的相关系数均未达到显著性水平（表2）。分析‘龙井43茶树花整个发育阶段（第1～4阶段）每个Cu/Zn-SOD基因表达量与Cu/Zn-SOD酶活性之间关联度（表3），相关系数均未达到显著性水平。

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