三七总皂苷抑制缺氧缺糖/复氧复糖诱导的SH-SY5Y细胞焦亡*

唐 标， 唐文静， 戴姿薇， 佘 旭， 邓常清

（湖南中医药大学医学院，长沙湖南410028）

脑缺血再灌注损伤作为缺血性脑卒中的重要环节，其损伤机制与线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性、凋亡、炎症等多因素有关［1-2］。细胞焦亡（pyroptosis）作为一种炎症相关的细胞死亡方式，参与了脑缺血再灌注中的炎症反应。当细胞焦亡启动后，gasdermin D（GSDMD）作为细胞焦亡的执行分子，其被活化后的GSDMD N 端片段（GSDMD N-terminal fragment，GSDMD-N）会形成聚合物并与细胞膜上的脂质分子形成孔道，导致细胞肿胀破裂，释放大量促炎因子，加重炎症反应［3］。已有研究表明，脑缺血再灌注诱导细胞焦亡，抑制细胞焦亡能减轻脑缺血再灌注损伤，细胞焦亡成为脑缺血再灌注损伤干预的重要靶点［4-6］。

三七是治疗心脑血管疾病的名贵中药，三七总皂苷（Panax notoginsengsaponins，PNS）是三七的主要有效成分，含多种单体皂苷，其制剂如血栓通注射液、血塞通注射液等在心脑血管疾病的防治中被广泛应用［7-8］。已有大量的研究揭示PNS及其有效成分具有抗炎、抗血栓、抗氧化、抗动脉粥样硬化、抑制脑神经细胞凋亡、促进血管新生、减轻脑缺血损伤等多方面的作用，但是其对细胞焦亡的调控作用和机制还不明确［9-11］。因此，本研究采用缺氧缺糖/复氧复糖（oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R）构建体外脑缺血再灌注SH-SY5Y 细胞模型，观察PNS对OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞焦亡的影响，探讨PNS 对OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞焦亡的调控机制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 细胞株 人神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y 购于中国科学院上海细胞生物学研究所。

1.2 药物及主要试剂 PNS（中国成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-14122912，纯度≥98%）；高糖 DMEM 和无糖DMEM 培养液（Gibco）；CCK-8 试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；兔抗人caspase-1、caspase-4 和 GSDMD 单克隆抗体（Cell Signaling Technology）；鼠抗人β-actin 单克隆抗体（Sigma）；山羊抗兔II 抗和山羊抗鼠II 抗（Merck Millipore）；人白细胞介素 1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 检测试剂盒、细胞凋亡与坏死检测试剂盒和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；人IL-18 ELISA 检测试剂盒（上海岚派生物科技有限公司）；兔抗人caspase-1 前体（procaspase-1）多克隆抗体和鼠抗人caspase-4前体（procaspase-4）单克隆抗体（Proteintech）。

1.3 主要仪器 CO2培养箱（长沙奇美仪器有限公司）；自动酶标仪（BioTek）；电泳仪、转膜仪和凝胶成像系统（Bio-Rad）；缺氧培养气室MC-101 和混合气阀（Billups-Rothenberg）。

2 方法

2.1 细胞培养 细胞用含10%胎牛血清和双抗的高糖DMEM 培养液，放置于37℃、5% CO2培养箱中培养。根据细胞生长状况，待细胞汇合度为90%左右时，用0.25%的胰蛋白酶消化收集细胞并传代，取对数生长期的细胞用于实验。

2.2 SH-SY5Y 细胞OGD/R 模型的建立 参照文献［12］，各组 OGD/R 预处理的细胞，以无糖 DMEM 培养液轻轻冲洗一遍，每孔加入37℃预热的无糖DMEM 培养液，放入缺氧培养气室中，持续通入95%N2和5% CO2的混合气体，1.5 L/min，持续6 min，以保证缺氧培养气室内缺氧环境的稳定和完全，通气结束后，关闭缺氧培养气室，放于培养箱中培养2 h；OGD处理结束后，各组细胞换回高糖DMEM培养液，并于37℃、5%CO2培养箱中继续培养，进行复氧复糖24 h。

2.3 细胞活力检测 取生长状态良好、汇合度为90% 的 SH-SY5Y 细胞，接种于 96 孔板，每孔 1×104个细胞，在37℃、5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培养液培养4 h。待细胞贴壁后，弃去原培，加入无血清培养液，培养24 h。同步化后，再弃原液，加入含药培养液100 μL（PNS浓度参照文献选择40、80、160、320、640 和1 280 mg/L［10-11］），同时设置不含药物、含培养液和细胞的空白对照（control）组，干预24 h。24 h 之后弃去原培养液，加含10%CCK-8 的培养液100 μL，另设空白孔（不含细胞，只含10%CCK-8的培养液）。在37℃、5%CO2培养箱中孵育1 h 后，用酶标仪检测其在450 nm 处的吸光度（absorbance，A）。实验每组设置6 个复孔，重复3次。细胞相对活力（%）=（样品平均A值-空白孔平均A值）/（空白对照组平均A值-空白孔平均A值）×100%。

另一实验设空白对照组、OGD/R 处理组及PNS干预组，亦进行细胞活力检测。各组细胞经接种培养、同步化后，空白对照组不做处理继续正常培养，OGD/R 处理组及PNS 干预组进行OGD 处理。OGD处理2 h后，OGD/R 处理组换以高糖DMEM 培养液进行复氧复糖24 h；PNS 干预组换以含PNS（根据细胞活力检测部分结果选择无显著细胞毒性的浓度:40、80、160和320 mg/L）的高糖DMEM 培养液进行复氧复糖24 h。各组中任何一组的任何一次换液，空白对照组也均平行换液，以排除换液对细胞损伤的影响。复氧复糖结束后进行CCK-8 实验，检测方法和分析同上。实验重复3次。

2.4 LDH 漏出率检测 各组细胞接种于96 孔板中，试验设空白对照组、OGD/R 处理组及PNS 干预组，同时设空白孔（不接种细胞，只加培养液），空白对照组设6 个复孔，其他组每组设置3 个复孔，各组处理方式同前。处理结束后，选取空白对照组中的3个复孔加入10 μL LDH 释放试剂，作为样品细胞最大酶活性对照孔，其他组每孔加入10 μL 培养液，继续于培养箱中培养1 h后，将细胞培养板用多孔板离心机400×g离心5 min。分别取各孔的上清液60 μL，加入到新的96 孔板相应孔中，各孔再分别加入60 μL LDH 检测工作液，轻轻混匀后，室温避光孵育30 min，在490 nm处测定A值。LDH漏出率（%）=（样品平均A值-空白孔平均A值）/（细胞最大酶活性孔平均A值-空白孔平均A值）×100%。实验重复3次。

2.5 Hoechst 33342/碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色检测 Hoechst 33342是一种可以穿透细胞膜并结合DNA 的蓝色荧光染料，可通过完整的细胞膜而使细胞核显蓝光；PI是一种可以嵌合到双链DNA 和RNA 的碱基对中并与之结合的荧光染料，无碱基特异性，仅能通过受损的细胞膜而使细胞核显红光。各组细胞接种于24 孔板，每孔1×105个细胞，分组和处理同前。处理后各孔加入5 μL Hoechst 33342 染色液和5 μL PI染色液，混匀，于4℃染色20 min，荧光显微镜下观察，随机选取3 个非重叠的视野，计数每个视野中的细胞总数及红色荧光细胞数，参照文献计算PI 阳性细胞比例［13］。PI 阳性细胞比例（%）=红色荧光细胞数/细胞总数×100%。每组设置3 个复孔，实验重复3次。

2.6 Western blot 检测焦亡相关蛋白 各组细胞接种于6 孔板内，每孔5×105个细胞，分组和处理同前。处理结束后去上清，用预冷PBS 洗1 次，每孔加含蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的裂解液50 μL，冰上裂解30 min，边裂解并用移液枪轻柔吹打，促进细胞裂解。裂解后，4℃、2 400×g离心10 min，取出含有组织总蛋白的上清液。加上样缓冲液后于沸水浴加热10 min，以使蛋白充分变性。经电泳、转膜、封闭，将膜与 I 抗［GSDMD（1∶1 000）、caspase-1（1∶1 000）、caspase-4（1∶1 000）、procaspase-1（1∶500）、procaspase-4（1∶500）和β-actin（1∶5 000）抗体］置于4℃孵育过夜，用 TBST 缓冲液洗膜后，将II 抗（1∶10 000 稀释）与膜于室温摇床上孵育60 min。ECL 显色曝光，用Quantity One 灰度分析软件进行图像定量分析，计算目的蛋白积分吸光度（integrated absorbance，IA）与内参照蛋白IA的比值，以此表示蛋白相对含量。每组设置3个复孔，实验重复3次。

2.7 ELISA 法检测细胞培养上清 IL-1β 和 IL-18 含量 细胞接种于24 孔板，分组和处理同前。处理结束后，细胞培养上清100×g离心5 min，取上清，按照试剂盒说明书进行检测。试剂盒于室温下平衡20 min后，将样品或稀释好的不同浓度标准品按照每孔100 μL 加入相应孔中，每孔设置1 个复孔。同时设置本底校正孔，即空白孔，设置方法为该孔只加TMB溶液和终止液。用封板膜封住反应孔，室温孵育120 min后，洗板5次，且最后一次置于厚吸水纸上拍干；每孔加入生物素化抗体100 μL，封孔后室温孵育60 min，洗板5 次；每孔加入辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素100 μL，室温避光孵育20 min，洗板5次；每孔加入TMB显色液100 μL，室温避光孵育20 min；每孔加入终止液50 μL，混匀后立即在450 nm 处测定A值。根据标准品浓度和A值绘制标准曲线，通过样品A值和标准曲线计算样品浓度。

3 统计学处理

使用SPSS 22.0 软件进行统计分析。所有数据为计量资料，均以均数±标准差（mean±SD）表示。服从正态分布的多组间均数比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用最小显著差异（least significant difference，LSD）法，方差不齐时采用Dunnett法；若不服从正态分布，则采用秩和检验。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 PNS提高OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞活力

CCK-8 结果显示，40、80、160 及320 mg/L 的PNS对细胞活力无明显影响（P＞0.05），说明该浓度范围的 PNS 无细胞毒性，640 及 1 280 mg/L 的 PNS 显著降低细胞活力（P＜0.01），因此选择≤320 mg/L 的浓度进行后续实验；此外，OGD/R处理后的SH-SY5Y细胞活力显著降低（P＜0.01），而80、160 及320 mg/L 的PNS显著提高OGD/R 处理后的SH-SY5Y 细胞活力（P＜0.05或P＜0.01），40 mg/L的PNS对OGD/R处理后的SH-SY5Y 细胞活力无明显影响（P＞0.05），因此选择80、160及320 mg/L的PNS进行后续实验，见图1。

2 PNS 降低 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞 LDH 漏出率

OGD/R 处理后的 SH-SY5Y 细胞 LDH 漏出率显著升高（P＜0.01），而 80、160 及320 mg/L 的PNS 干预能显著降低OGD/R 处理后的SH-SY5Y 细胞LDH 漏出率（P＜0.05或P＜0.01），见图2。

Figure 1.The effect of PNS on the viability of SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group； #P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.图1 PNS对SH-SY5Y细胞活力的影响

Figure 2.The effect of PNS on the LDH leakage of SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.图2 PNS对SH-SY5Y细胞LDH漏出率的影响

3 PNS 降低 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞 PI 染色阳性细胞比例

Hoechst 33342/PI 染色结果显示，control 组少见红色荧光，OGD/R 处理后的SH-SY5Y 细胞红色荧光增加，PI 阳性细胞显著增加（P＜0.01）；与OGD/R 组比较，PNS 组细胞红色荧光减少，PI 阳性细胞显著减少（P＜0.01），见图3。

4 PNS降低OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞GSDMD和GSDMD-N蛋白表达

Western blot 结果显示，与 control 组比较，OGD/R组细胞GSDMD 和GSDMD-N 蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与 OGD/R 组比较，PNS 组 GSDMD 和 GSDMDN蛋白表达显著降低（P＜0.01），见图4。

5 PNS 降低 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞 caspase-1和caspase-4蛋白表达

Western blot 结果显示，与 control 组比较，OGD/R处理后的 SH-SY5Y 细胞 procaspase-1、procaspase-4、caspase-1 和caspase-4 蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与 OGD/R 组比较，PNS 组细胞 caspase-1 和 caspase-4蛋白表达显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），但procaspase-1 和procaspase-4 蛋白的表达无显著变化（P＞0.05），见图5。

6 PNS抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞IL-1β和IL-18分泌

ELISA 结果显示，与 control 组比较，OGD/R 组细胞培养上清中 IL-1β 和 IL-18 含量显著增加（P＜0.01）；与 OGD/R 组比较，PNS 组细胞培养上清中IL-1β和IL-18含量显著降低（P＜0.05 或P＜0.01），见图6。

讨 论

OGD/R 是构建脑缺血再灌注体外模型的常用方法［14-15］。本研究以 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞构建脑缺血再灌注体外模型，探讨PNS 对OGD/R 诱导的细胞焦亡的调控作用和机制，结果显示，OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞活力明显降低，而PNS 干预能显著提高OGD/R 诱导SH-SY5Y 细胞活力。前期有大量体内、体外研究探讨PNS 在脑缺血再灌注中的保护作用，其结果均表明PNS 能减轻脑缺血再灌注损伤［9-11］。

细胞焦亡是一种炎症相关的细胞死亡方式，介导了脑缺血再灌注损伤的发生和发展过程［16］，因此本研究从细胞焦亡途径探讨PNS 抗脑缺血再灌注损伤机制。细胞焦亡的主要特征为细胞膜穿孔，通透性变大，细胞焦亡执行蛋白GSDMD 被活化［3］。本研究结果显示OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞LDH 漏出率明显升高，PI染色红色荧光增强，PI阳性细胞比例明显升高，表明细胞膜通透性增加，同时结果显示OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞GSDMD 蛋白及其主要活化产物GSDMD-N 的表达明显增加，这与已有研究结果一致［4］，再结合OGD/R 可诱导原代星形胶质细胞和 PC12 细胞焦亡的报道［5，17］，表明 OGD/R 可诱导SH-SY5Y细胞焦亡。而PNS干预后LDH漏出率明显降低，PI染色红色荧光减弱，PI阳性细胞比例显著降低，细胞GSDMD 蛋白及其主要活化产物GSDMD-N的表达明显减少，结合抑制GSDMD 可以抑制细胞焦亡、减轻脑缺血再灌注损伤的报道［4-5］，提示PNS可能通过抑制细胞焦亡减轻OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞损伤。

Figure 3.The effect of PNS on SH-SY5Y cells with Hoechst 33342/PI staining.A:Hoechst 33342/PI staining in SH-SY5Y cells of each group（scale bar=50 μm）；B:the percentage of the PI positive cells to total cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图3 PNS对SH-SY5Y细胞Hoechst 33342/PI染色的影响

Figure 4.The effect of PNS on protein expression of GSDMD and GSDMD-N in SH-SY5Y cells.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs OGD/R group.图4 PNS对SH-SY5Y细胞GSDMD和GSDMD-N蛋白表达水平的影响

Figure 5.The effect of PNS on protein expression of caspase-1 and caspase-4 in SH-SY5Y cells.The protein levels of procaspase-1，caspase-1，procaspase-4 and caspase-4 in each group were detected by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.图5 PNS对SH-SY5Y细胞caspase-1和caspase-4蛋白表达水平的影响

Figure 6.The effect of PNS on the levels of IL-1β（A）and IL-18（B）in the supernatants.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs OGD/R group.图6 PNS对SH-SY5Y细胞培养上清中IL-1β和IL-18含量的影响

GSDMD 的 活 化 由 caspase-1/4/5/11 介 导 ，caspase-4/5 为小鼠 caspase-11 在人体中的同源蛋白［18］。本研究进一步观察了PNS对OGD/R 诱导的SH-SY5Y细胞 caspase-1、caspase-4、procaspase-1 和 procaspase-4 表达的影响，结果显示 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞 caspase-1、caspase-4、procaspase-1 和 procaspase-4的表达明显增加，这与已有研究报道一致［19］，表明OGD/R 可诱导 caspase-1 和 caspase-4 活化。而 PNS干预对procaspase-1 和procaspase-4 的表达无显著影响，但显著降低caspase-1 和caspase-4 的表达，提示PNS 干预能抑制OGD/R 诱导的SH-SY5Y 细胞caspase-1 和caspase-4 活化。已有研究证实，在小鼠脑缺血再灌注中存在caspase-1 和caspase-11 的活化，抑制其活化可减轻脑缺血再灌注损伤［19-20］，提示PNS可能通过抑制caspase-1 和caspase-4 的活化而抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞焦亡。

此外，caspase-1 和caspase-11 的活化将剪切IL-1β 和 IL-18 的前体，生成 IL-1β 和 IL-18，细胞焦亡发生导致细胞膜损伤，IL-1β和IL-18被释放［3］。本研究结果显示OGD/R 处理后的SH-SY5Y 细胞培养上清中 IL-1β 和 IL-18 含量显著增加，而 PNS 干预后细胞细胞培养上清中IL-1β 和IL-18 含量显著降低，表明PNS 能抑制 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞 IL-1β 和 IL-18的释放。

已有研究报道，OGD/R 能诱导细胞焦亡［4］。本研究结果揭示OGD/R 诱导SH-SY5Y 细胞焦亡，并且PNS 能抑制 caspase-1、caspase-4 和 GSDMD 的剪切活化，从而抑制OGD/R诱导的SH-SY5Y细胞焦亡。

综上所述，OGD/R 可诱导SH-SY5Y 细胞焦亡，PNS 能减轻 OGD/R 诱导的 SH-SY5Y 细胞损伤，其机制与抑制细胞焦亡以及IL-1β和IL-18的释放有关。