干扰PARP-1基因对人胃癌HGC-27细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响

费 晶，巩 平

石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科 新疆石河子 832000

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，多种因素导致胃癌的发生和发展，其发病机制非常复杂[1]。据报道[2]，我国胃癌的疗效在一定程度上有所改善，但由于缺乏特定症状，早期胃癌诊断困难。胃切除术联合放疗广泛用于胃癌的治疗，然而晚期胃癌患者的预后并不理想。基因治疗在肿瘤治疗中越来越受到重视，许多癌基因和抑癌基因的异常表达可能影响肿瘤细胞凋亡、放射敏感性和患者预后[3]。因此，已经提出了肿瘤基因治疗和放射治疗联合的治疗手段。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1[poly(ADP-ribose)polymerase-1，PARP-1]是一种修复DNA链断裂的基因，参与维持基因组的完整性[4]。研究[5]表明，肿瘤细胞经X射线照射后PARP-1的表达迅速升高，可修复DNA损伤进而降低肿瘤细胞的放射敏感性。已有报道[6-8]发现沉默PARP-1基因可增强卵巢癌细胞、乳腺癌细胞及宫颈癌细胞等的放射敏感性。有研究[9]发现，PARP-1在胃癌组织中亦呈高表达。本研究观察了干扰PARP-1的表达对胃癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响，以期为胃癌的基因治疗提供可能的作用靶点。

1 材料与方法

1.1材料人正常胃黏膜上皮细胞GES-1及人胃癌细胞MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27均购自美国ATCC细胞库。PARP-1抗体、GAPDH抗体、Caspase-3抗体、Caspase-8抗体及辣根过氧化物酶标记的二抗均购自美国CST公司，CCK-8检测试剂盒购自日本Dojindo公司，Annexin-Ⅴ/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购自日本TaKaRa公司，特异性PARP-1 siRNA和非特异性siRNA(si-NC)均由上海吉玛制药技术有限公司合成，RPMI 1640培养基、胎牛血清购自美国Gibco公司，Trizol试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购自美国Promega公司，Lipofectamine 2000脂质体转染试剂购自美国Invitrogen公司，细胞裂解液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、ECL化学发光试剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2细胞培养GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27细胞均在含体积分数10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中，37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。根据各细胞生长状态及时更换培养基，待细胞生长至汇合度达80%以上时，使用胰蛋白酶消化细胞，并进行传代培养。取处于对数生长期的细胞进行后续实验。

1.3不同细胞PARP-1mRNA表达的检测采用Trizol法分别提取GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27细胞的总RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA。PARP-1引物序列：上游5’-AAGGCGAATGCCAGCGTTAC-3’，下游5’-GGCACTCTTGGAGACCATGTCA-3’；GAPDH引物序列：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-AUAAUUUCAUGAAGUGCUCTT-3’。以上引物均由上海生工生物工程有限公司合成。根据荧光定量PCR检测试剂盒说明进行扩增，以GAPDH为内参。20 μL反应体系：cDNA模板0.8 μL，上、下游引物(0.2 μmol/L)各0.8 μL，2×SYBR Green qPCR Mix 10 μL，ddH2O 7.6 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算PARP-1 mRNA的相对表达量。实验重复3次。

1.4HGC-27细胞转染及分组取HGC-27细胞接种于6孔板，继续培养24 h，待细胞贴壁生长，汇合度达50%时分为3组，si-PARP-1组和阴性对照组采用脂质体法分别转染特异性PARP-1 siRNA和si-NC，未转染的HGC-27细胞为空白对照。转染后各组细胞置于37 ℃恒温培养箱继续培养。以下实验每组细胞设置3个平行孔，重复3次。

1.53组HGC-27细胞PARP-1mRNA和蛋白表达的检测转染48 h后提取3组HGC-27细胞的总RNA，同1.3方法检测PARP-1 mRNA的表达。分别收集转染48 h后各组HGC-27细胞，加入细胞裂解液提取蛋白，采用BCA试剂盒检测蛋白浓度，在蛋白样品中加入适量加样缓冲液，沸水浴中加热15 min致蛋白变性。在上样孔中加入等量变性蛋白样品，行SDS-PAGE电泳，分离蛋白后电转至硝酸纤维素膜上，置于含50 g/L脱脂奶粉中封闭2 h。加入PARP-1一抗(1∶800稀释)，4 ℃下过夜。再加入按1∶3 000稀释的二抗，室温下1 h，采用ECL化学发光，显影，以GAPDH为内参，计算目的蛋白的相对表达量。

1.63组HGC-27细胞增殖能力的检测转染24、48、72、96 h时，分别取3组细胞，每孔细胞中加入CCK-8试剂10 μL，置37 ℃培养箱继续孵育4 h，使用酶标仪检测波长490 nm处吸光度(A)值。

1.73组HGC-27细胞凋亡检测分别收集转染48 h后3组HGC-27细胞，胰蛋白酶消化后，加入100 μL结合缓冲液重悬细胞，调整细胞密度为1×105个/mL，采用Annexin-Ⅴ/PI双染法，室温下避光进行，再加入400 μL结合缓冲液，在1 h内上流式细胞仪检测凋亡率。

1.83组HGC-27细胞Caspase-3、Caspase-8蛋白表达的检测采用Western blot法检测3组HGC-27细胞Caspase-3、Caspase-8蛋白的表达，方法同1.5，其中Caspase-3和Caspase-8一抗均按1∶1 000稀释。

1.93组HGC-27细胞放射敏感性检测转染48 h后，3组HGC-27细胞分别接种于6孔板，待细胞贴壁后，分别给予6 MV X射线(单次剂量为0、2、4、6、8 Gy)照射6 h后于37 ℃培养箱常规培养2周，用多聚甲醛固定30 min，吉姆萨染色15 min，洗去染液后晾干，在显微镜下观察、计数，以>50个细胞的克隆为有效克隆，克隆形成率=克隆形成数/接种细胞数×100%。

1.10统计学处理采用SPSS 21.0处理数据。应用单因素方差分析比较不同细胞间PARP-1 mRNA表达的差异，以及3组HGC-27细胞PARP-1 mRNA和蛋白表达水平、增殖能力、凋亡率、克隆形成率和Caspase-3、Caspase-8蛋白表达的差异，两两比较应用SNK-q检验，检验水准α=0.05。

2 结果

2.16种细胞中PARP-1mRNA表达水平的比较GES-1、MKN-45、MGC-803、SGC-7901、AGS、HGC-27细胞中PARP-1 mRNA的表达水平分别为(0.86±0.10)、(1.42±0.16)、(1.39±0.15)、(2.42±0.30)、(1.87±0.22)、(3.28±0.35)，PARP-1在人胃癌细胞中的表达均高于GES-1(P<0.05)，且在HGC-27细胞中表达量最高，因此选择HGC-27细胞进行后续实验。

2.23组HGC-27细胞中PARP-1表达水平的比较转染48 h后，si-PARP-1组HGC-27细胞中PARP-1 mRNA和蛋白表达低于空白对照组和si-NC组(P<0.05)，而si-NC组和空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示转染PARP-1 siRNA能够干扰胃癌HGC-27细胞PARP-1的表达。见图1和表1。

1～3：分别为空白对照组、si-NC组和si-PARP-1组

表1 3组HGC-27细胞中PARP-1 mRNA和蛋白表达水平的比较(n=3)

2.33组HGC-27细胞增殖能力比较转染48、72和96 h，与空白对照组和si-NC组相比，si-PARP-1组HGC-27细胞A值降低，提示细胞增殖能力减弱，见表2。

表2 3组HGC-27细胞增殖能力比较(n=3)

2.43组HGC-27细胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平的比较与空白对照组和si-NC组相比，si-PARP-1组HGC-27细胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平升高(P<0.05)。见图2和表3。

1～3：分别为空白对照组、si-NC组和si-PARP-1组

表3 3组HGC-27细胞凋亡率及Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平比较(n=3)

2.53组HGC-27细胞放射敏感性的比较与空白对照组和si-NC组相比，不同照射剂量下si-PARP-1组细胞克隆形成率均降低(P<0.05)，见表4。

表4 不同照射剂量下3组细胞克隆形成率比较(n=3) %

3 讨论

胃癌是全球癌症相关死亡的第二大常见原因；胃癌的发生率在世界不同地区之间存在明显差异，在东亚尤其常见[10]。虽然手术是胃癌的主要治疗方法，但放射治疗在胃癌的辅助和姑息治疗中也起着重要作用，而肿瘤细胞的放射敏感性决定了放疗效果。放射治疗的分子机制主要是通过电离辐射损伤DNA双链，而多种修复途径通过修复DNA损伤降低放射治疗效果[11]。研究[12]证实，PARP-1基因具有DNA损伤修复的功能，可修复电离辐射导致的DNA双链断裂，因此靶向抑制PARP-1的表达对放射增敏具有重要意义。有研究[13]显示，PARP-1的高表达与胃癌的侵袭和预后不良密切相关。但有关PARP-1基因参与胃癌细胞放射敏感性的研究鲜见报道。

本实验首先通过qRT-PCR检测了人正常胃黏膜上皮细胞GES-1及不同胃癌细胞中PARP-1 mRNA的表达情况，结果显示，PARP-1 mRNA在胃癌细胞尤其是HGC-27细胞中的表达显著高于GES-1细胞。将特异性PARP-1 siRNA转染HGC-27细胞，结果表明，转染特异性PARP-1 siRNA可有效干扰PARP-1的表达，且转染后HGC-27细胞增殖受抑，细胞凋亡率升高，Caspase-3和Caspase-8蛋白表达水平升高；接受不同剂量X射线照射后，干扰PARP-1表达的HGC-27细胞克隆形成率降低，表明干扰PARP-1基因可提高HGC-27细胞的放射敏感性，这与Feng等[14]在乳腺癌，Kötter等[15]在胰腺癌PC3细胞、宫颈癌HeLa细胞和肺腺癌H1299细胞等中的研究相符。研究[16-17]显示Caspase-3是细胞凋亡过程中的最终执行者，其激活可促进细胞凋亡；而Caspase-8是细胞凋亡通路中的启动基因，可激活下游Caspase-3。因此推测PARP-1影响胃癌细胞放射敏感性的机制可能与Caspase-8/Caspase-3途径有关。

综上，干扰PARP-1基因可抑制胃癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，增加细胞的放射敏感性；PARP-1基因有望成为胃癌基因治疗的新靶点。干扰PARP-1基因是否通过Caspase-8/Caspase-3途径影响胃癌细胞的放射敏感性有待验证。此外，本实验在干扰PARP-1基因后只通过Western blot法检测Caspase-3和Caspase-8蛋白的表达水平，未涉及Caspase-8/Caspase-3途径上下游基因的变化，存在不足，后续实验将对此进行补充并验证。