头颈部鳞状细胞癌中Klotho基因表达及其甲基化水平与LC3和NSUN2基因表达的相关性*

胡娟娟， 王 旭， 朱立新， 朱 云

华中科技大学同济医学院附属协和医院耳鼻咽喉科，武汉 430022

近年来，头颈部肿瘤(head and neck cancer，HNC)的发病率在世界范围内已位居肿瘤发病率第6位，且大约90%头颈部肿瘤患者的病理分型为头颈部鳞状细胞癌(head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC)[1]。尽管近40年来治疗方式在不断地更新改进，但HNSCC患者的预后生存情况仍然没有得到明显的改善，其术后5年生存率<50%[2]。然而，如果能够在早期进行诊断，其术后5年生存率可以升高至80%[3]。因此，寻找一种特异的生物标志物，尤其是在疾病早期，对HNSCC的治疗变得尤为关键。

Klotho(KL)蛋白是由1012个氨基酸组成的单跨膜蛋白[4]。其胞外结构域可以断裂并被释放到血液、尿液和脑脊液中[5]，是一种激素调节相关的生理过程[6]。KL最初是在1997年作为抗衰老基因被发现的[7]，但近来发现KL在多种肿瘤中显现出较强的肿瘤抑制作用，包括在乳腺癌[7-9]、肾细胞癌[10]、甲状腺癌[11]、肺癌[12]、胰腺癌[4]、口腔癌和食管鳞状细胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[13]等癌症中。在许多肿瘤组织中，与正常组织或癌旁组织比较，KL的表达水平均降低；另一方面，提高或恢复KL表达水平则会抑制肿瘤细胞的增殖[4-8]。在表观遗传学上，KL的表达受其DNA启动子区域甲基化的调节，这也是癌症中常见的一种DNA修饰方式[14]。有报道称，KL的启动子区域过甲基化会沉默KL、抑制其表达，进而导致其肿瘤抑制功能的丧失[9]。事实上，在许多恶性肿瘤中已经发现存在KL启动子区域过甲基化的现象，如HNSCC[15]、乳腺癌[9]、结肠直肠癌[16]和宫颈癌[17]。在HNSCC患者中，有报道称自噬相关基因LC3及RNA甲基转移酶基因NSUN2的表达水平也发生改变[18-19]，这引起了我们对两者之间是否有关联的研究兴趣。

因此，本研究的目的在于探究HNSCC患者KL的表达及其启动子区域甲基化水平变化，以及与自噬相关基因LC3和新近发现的HNSCC预后指标RNA甲基转移酶基因NSUN2之间的关系。

1 资料与方法

1.1 TCGA数据库来源的HNSCC患者资料

在癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas,TCGA)数据库中收集到的538例HNSCC患者的信息中，有525例患者的肿瘤样本应用转录组测序技术(RNA-seq)进行了RNA水平测定和应用Illumina DNA甲基化矩阵HM450 进行了DNA甲基化水平的测定，我们对此进行了统计分析[20]。HNSCC患者525例，其中男性386例，女性138例，性别不明1例，平均60.9岁(19～90岁)；肿瘤位于舌部的200例，位于咽部137例，位于头颈部的其他部位188例；可得到相关种族信息的患者506例，其中高加索人占88.1%，非裔美国人占9.3%，亚洲人占2.2%，本土美洲人占0.4%；有吸烟史患者393例，无吸烟史患者132例；疾病分期上，Ⅳ期患者284例，Ⅲ期患者106例，Ⅱ期患者99例，Ⅰ期患者36例；肿瘤分级上，Ⅰ级患者63例，Ⅱ级患者307例，Ⅲ级患者155例；可得到术后放疗信息的患者183例，其中术后接受放疗的患者121例，术后未接受放疗的患者62例；可得到随访信息的患者523例，平均总生存期21.2月。

1.2 基因表达及DNA甲基化分析

如前述，在TCGA数据库中得到的有随访记录的523例患者的信息中，我们收集了关于患者标准化的上四分位KL表达的转录组测序(RNA-seq V2 RNA-seq by expectation maximization，RSEM)值和KL启动子区域甲基化的β值(beta-value)，通过甲基化和未甲基化等位基因间的强度比评估DNA甲基化水平。

1.3 统计学分析

本研究数据均使用SAS 9.2软件(SAS Institute Inc.)进行统计学分析。总生存期从手术开始计算直到患者死亡或者失访。以KL表达水平及其DNA启动子区域甲基化水平作为分类指标且据此分别将患者由低到高进行排序，并从三分位处将患者分为低、中、高表达3组；消除了年龄因素在诊断、疾病分期、肿瘤分级、性别和是否有吸烟史中的影响后，采用K-M生存曲线(Kaplan-Meier survival curve)来评价KL表达及其启动子区域甲基化与患者生存期之间的关系。采用Spearman相关性检测分析KL表达与其启动子区域甲基化、NSUN2或者LC3表达之间的关系。当P<0.05时，被认为具有统计学意义。

2 结果

2.1 KL的表达及其DNA甲基化与患者生存率之间的关系

采用K-M生存曲线分析KL表达水平与总生存期之间关系，结果显示(图1)：KL高表达患者总生存期明显高于低表达的患者(Log-rankP=0.002)；高、中、低表达组总生存期的中位数分别为68.5月(95%CI：42.3～210.8月)、56.8月(95%CI：35.8～153.8月)、32.6月(95%CI：22.3～65.8月)，高、低表达组总生存期之间的差异为35.9月，低表达组的生存曲线与中、高表达组的曲线出现了明显的分离；与低表达组相比，高表达组风险比(HR)为0.59(95%CI：0.42～0.81，P=0.001)、中表达组风险比为0.68(95%CI：0.50～0.93，P=0.015)，该趋势具有统计学意义(Ptrend=0.001)。

图1 据KL表达水平分级的Kaplan-Meier生存曲线Fig.1 Kaplan-Meier survival curve graded according to KL expression level

相反的是，采用K-M生存曲线分析KL的DNA甲基化水平与总生存期之间关系，结果显示(图2)：KL的DNA高水平甲基化组的患者与低水平甲基化组的患者相比，其总生存期有下降趋势(Log-rankP=0.057)；低、中、高水平甲基化组患者其总生存期的中位数分别为57.8月(95%CI：47.9～159.5月)、48.3月(95%CI：32.5～89.3月)、37.2月(95%CI：22.2～65.8月)，低水平甲基化组患者总生存期要比高水平甲基化组高出20.6月；与低水平甲基化组相比，中水平甲基化组风险比为1.23(95%CI：0.87～1.74，P=0.251)，高水平甲基化组风险比为1.51(95%CI：1.07～2.08，P=0.018)，该趋势具有统计学意义(Ptrend=0.017)。

图2 据KL的DNA甲基化水平分级的Kaplan-Meier生存曲线Fig.2 Kaplan-Meier survival curve graded according to KL methylation level

2.2 KL的表达及其DNA甲基化水平与LC3及NSUN2表达的相关性

为了探究KL的表达及其DNA甲基化作为HNSCC患者生存预后因素的可能机制，我们又对其与自噬相关基因LC3和RNA甲基转移酶基因NSUN2表达之间的相关性进行了分析。结果显示，KL的表达水平与LC3的表达水平呈正相关(rs=0.17，P=0.003；图3A)，而KL的DNA甲基化水平与LC3的表达水平呈负相关(rs=-0.27，P<0.001；图3B)。同时，KL的表达水平与NSUN2的表达水平呈负相关(rs=-0.16，P<0.001；图4A)，而KL的DNA甲基化水平与NSUN2的表达呈正相关(rs=0.15，P=0.004；图4B)。

A：：KL的表达水平与LC3的表达水平呈正相关(rs=0.17，P=0.003)；B：KL的DNA甲基化水平与LC3的表达水平呈负相关(rs=-0.27，P<0.001)图3 KL的表达水平及其DNA甲基化水平与LC3基因表达间的相关性Fig.3 The correlation of KL expression level and DNA methylation level with LC3 gene expression

A：KL的表达水平与NSUN2的表达水平呈负相关(rs=-0.16，P<0.001)；B：KL的DNA甲基化水平与NSUN2的表达呈正相关(rs=0.15，P=0.004)图4 KL的表达水平及其DNA甲基化水平与NSUN2基因表达间的相关性Fig.4 The correlation of KL expression level and DNA methylation level with NSUN2 gene expression

3 讨论

在本研究中，我们发现KL高水平表达的患者或者其启动子区DNA低水平甲基化的患者有着较低的死亡风险和更长的总生存期，提示KL的表达及其启动子区域甲基化可成为判断HNSCC预后的潜在生物标志物。此外，我们还发现KL的表达及其DNA甲基化与LC3和NSUN2的表达之间也存在着明显的相关性。

KL蛋白作为一种抗衰老的激素参与到细胞寿命与细胞稳态的调节中。有报道称，KL作为肿瘤抑制基因通过下调胰岛素生长因子(insulin growth factor，IGF)信号通路来发挥其肿瘤抑制效应，而在多种肿瘤发生和发展中均涉及到该信号通路，如肾细胞癌[10]、乳腺癌[21]、肺癌[9，22]、胰腺癌[4]和头颈部肿瘤[9，12-13，23-24]。与正常组织相比，在肿瘤组织中往往伴随着KL表达水平的显著降低[10，17，25]。不仅如此，KL蛋白水平的下降往往伴随着KL启动子区域甲基化水平的升高，这与多种癌症的不良预后是相关联的，如肝细胞癌[24]、胃癌[26]和食管鳞状细胞癌[23]。体外细胞实验也表明了KL表达水平的恢复或者使用可溶性的KL蛋白处理细胞后可以抑制肿瘤细胞的增殖[17，25]。

除了下调胰岛素生长因子信号通路之外，KL也可以通过拮抗Wnt/β连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路[27-28]，进而抑制致癌基因的表达[如c-myc和细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)]来发挥其肿瘤抑制效应。也有报道称，KL通过直接与TGF-β受体结合从而抑制TGF-β1诱导的上皮-间质细胞转换(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生[29]。我们之前的研究结果揭示了在HNSCC患者中，TWIST1作为EMT中的关键调节因子，其高水平表达与患者的不良预后明显相关[30]。在本研究中，我们也观察到KL的mRNA水平与HNSCC患者总生存期之间存在着明显的正相关关系，KL高水平表达的患者其总生存期比低水平表达的患者平均高出35.9月。这些发现为证实KL在人类癌症中发挥肿瘤抑制功能提供了有力的证据。

由于KL的启动子区域存在富含双核苷酸“CG”的CpG岛(CpG island)，故其表达可以被KL的DNA甲基化所沉默[9，25]，且去甲基化试剂5-氮杂2′-脱氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine)可以使KL的表达恢复[26，31]。正如我们所预期的那样，在本研究中，KL的高水平表达及低水平甲基化与较低的死亡风险和较高的总生存期是相关的。之前有报道称肿瘤组织与周围正常组织相比有着较高的KL甲基化水平[9，16，26]，且高水平甲基化与多种癌症的不良预后和严重程度明显相关[16，32-33]，而我们的发现与之是一致的。这些研究数据均表明了KL启动子区域甲基化在HNSCC的进展中起着重要的作用[34-35]。

细胞自噬在通过降解错误折叠的蛋白和清除损伤的细胞器来维持细胞的稳态过程中起着重要的作用。此外，在肿瘤的不同阶段自噬可以分别起到促进或者抑制肿瘤生长的作用,在早期，细胞的自噬可促进肿瘤的发生和发展，而在晚期，自噬的激活却会起到抗癌作用[19]。在口腔舌鳞癌(oral tongue squamous cell carcinoma，OTSCC)患者中，有证据表明自噬相关基因beclin-1的表达在肿瘤组织中是降低的，且往往伴随着不良的预后，而其过表达则会抑制OTSCC细胞的增殖和克隆[36]。LC3是针对自噬小体的一种特异性标记物，我们发现，HNSCC患者体内KL表达水平与LC3水平呈正相关，而KL甲基化水平与其呈负相关。也有报道称KL在多种肿瘤中通过激活细胞自噬来发挥其肿瘤抑制功能[32，37]，本研究结果提示，在HNSCC中，LC3和KL之间存在着一定的关系。

NSUN2是一种RNA甲基转移酶，它参与到细胞的增殖和分化过程中[38-39]。NSUN2受到原癌基因MYC的直接调控[40]，有报道称NSUN2的过表达与多种肿瘤的进展有关，如乳腺癌[41]和HNSCC[18]，并且NSUN2的高水平表达与HNSCC患者的不良预后呈正相关[18]。最近有报道称NSUN2也是Lef/β-连环蛋白(Lef/β-catenin)复合物的转录靶点[38]，而该下游通路可被KL表达所抑制[42]。本研究结果显示，在HNSCC患者中，NSUN2与KL的表达水平呈负相关，与KL启动子区域甲基化水平呈正相关，这与之前他人研究结果是一致的。我们的研究首先揭示了，在HNSCC中，NSUN2和KL之间也存在着一定的关系。

本研究指出了KL基因的表达水平及其启动子区域甲基化水平可作为HNSCC潜在的预后生物标志物，且与LC3和NSUN2之间存在着一定关系的。接下来我们将会对LC3和NSUN2进行进一步研究，探讨它们作为KL的下游靶点在HNSCC中发挥着怎样的作用。