广西降香黄檀炭疽病菌的生物学特性分析

闪 瑶，廖旺姣，邹东霞，吴耀军，黄华艳，黄乃秀

(1.广西国有高峰林场，广西 南宁 530000；2.广西壮族自治区林业科学研究院，广西 南宁 530002)

【研究意义】降香黄檀(DalbergiaodoriferaT.Chen)俗称海南黄花梨，是目前广西大力推广种植的珍贵树种，其心材是名贵家具和工艺品的优质材料，经济价值极高。但大面积营造纯林后病虫发生为害较普遍，其中炭疽病危害会引起降香黄檀严重落叶，影响树木正常生长[1-4]。蜘蛛兰炭疽菌(Colletotrichumhymenocallidis)是降香黄檀炭疽病的一种新病原菌，目前对其生物学特性了解甚少。因此，分析降香黄檀炭疽病蜘蛛兰炭疽菌的生物学特性，对监控由该菌引起的炭疽病发生流行动态和制定有效的防控策略具有重要意义。【前人研究进展】伍慧雄等[2]、梁远楠[3]调查发现，炭疽病是危害广东肇庆市降香黄檀的主要病害。董文统等[4]调查显示，炭疽病是危害降香黄檀的主要病害。关于病原菌，桑利伟等[5]、董文统[6]研究表明，胶孢炭疽菌[Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc.]是海南省降香黄檀炭疽病的病原菌。吴奉奇[7]研究认为，暹罗刺盘孢(Colletotrichumsiamense)是广东肇庆市降香黄檀炭疽病病原菌。在病害防治方面，董文统[6]开展海南省降香黄檀炭疽病的生物学特性和病害流行规律研究，发现丙环唑、氟硅唑和吡唑醚菌酯?代森3种药剂室内毒力测定效果较好；章颖等[8]通过室内药剂毒力测定，发现溴菌腈、吡唑醚菌酯和苯醚甲环唑对降香黄檀炭疽病菌菌丝生长的抑制效果较佳；陈彧等[9]从降香黄檀叶片中分离筛选出对炭疽病抑菌率较高的拮抗细菌Y23；周洁尘等[10]从13种海南省外来入侵植物中筛选出垂序商陆和胜红蓟2种对降香黄檀炭疽病菌起良好抑菌作用的植物。【本研究切入点】已有研究表明，炭疽病的病原菌在降香黄檀不同栽培生境存在差异[5-7]，本研究在广西获得的降香黄檀炭疽病病原菌与海南省和广东省不同，但针对其生物学特性的研究未见报道。【拟解决的关键问题】分析影响降香黄檀炭疽病蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的温度、pH、碳氮源和光照等因子，为降香黄檀炭疽病的监测及防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

采集广西崇左市林业科学研究所降香黄檀苗圃感染炭疽病的降香黄檀叶片，按常规组织分离获得纯培养，经单孢纯化，依据柯赫氏法则测定其致病性，参考廖旺姣等的方法[11]采用形态特征和分子系统学鉴定后，保存至PCA斜面培养基，选择性状优良的HC01菌株作为供试菌株，移入PDA培养基[12]平板上培养(25 ℃) 6 d后供测试用。

1.2 试验方法

1.2.1 温度对菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响 将HC01菌株在PDA培养基上培养6 d，以内径为6 mm的灭菌打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到PDA平板中间，分别置于5、10、15、20、25、28、30、35和40 ℃温度条件下暗培养，各温度处理均设3个重复。接种6 d后以十字交叉法测量菌落直径，于接种15 d后用血球计数板计算产孢量[13-14]。挑取蜘蛛兰炭疽菌的分生孢子，将用PDB培养液[12]配制的孢子悬浮液(2.00×106个/mL)滴在凹面玻片上，分别置于上述9个温度下保湿培养，6 h后镜检孢子萌发率，每处理6个重复，每重复检查100个孢子。

1.2.2 湿度对分生孢子萌发的影响 参考廖旺姣等[14]的小容器空气湿度调节法，将分生孢子液(浓度同1.2.1)涂抹于载玻片上，阴干后置于50 %～100 %范围内的7种不同湿度干燥器中，每处理3个重复，室温(25 ℃)下保湿6 h后镜检其孢子萌发率。

1.2.3 pH对菌丝生长的影响 配制PDB培养液，用1 mol/L HCl和NaOH将其调配为pH 2～12(间隔为1)的培养液，分别接入3块直径为6 mm的菌饼，3个重复，28 ℃、130 r/min振荡培养，10 d后过滤收集菌丝，80 ℃烘干至恒重后，称量菌丝干重。

1.2.4 碳和氮源对菌丝生长及产孢的影响 参考方中达[12]的方法，以Czapek为基础培养基，分别用等质量的D-果糖等9种碳源置换蔗糖，配制成含不同碳源的培养基；用等质量的尿素等9种氮源置换硝酸钠，配制成含不同氮源的培养基。挑取直径为6 mm的菌饼接种至上述不同碳、氮源培养基平板中央，每处理3个重复，置于25 ℃恒温下暗培养6 d后，按1.2.1方法测定菌落直径和产孢量。

1.2.5 光照对菌丝生长及产孢的影响 设完全黑暗、连续光照、12 h光暗交替(8 W，灯皿距离20 cm) 3个光照条件，参考廖旺姣等[13]的方法，挑取直径6 mm的菌饼接种于PDA平板中央，置于上述光照条件下25 ℃恒温培养，培养6 d后按1.2.1方法测定菌落直径和产孢量。

1.3 统计分析

试验数据采用DPS 13.01进行整理，以Duncan's新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 温度对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

由表1可知，蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长温度范围为10～35 ℃，温度过低(5 ℃)或过高(40 ℃)菌丝不生长，28和30 ℃时菌丝生长最快，其次是25和35 ℃。方差分析结果显示，30 ℃处理蜘蛛兰炭疽菌的菌落直径最大，其次为28 ℃处理，二者间无显著差异(P>0.05，下同)，但均显著大于其他温度处理的菌落直径(P<0.05，下同)，说明28～30 ℃较适蜘蛛兰炭疽菌生长；蜘蛛兰炭疽菌在10～35 ℃均能产生分生孢子，其中在28 ℃时产孢量最大，25 ℃次之，二者间差异不显著，但均显著大于其他温度处理，说明25～28 ℃为较适宜蜘蛛兰炭疽菌产孢的温度；分生孢子在15～30 ℃均能萌发，其中在20～30 ℃萌发率均在89.33 %以上，而在28 ℃时萌发率最高，30 ℃时次之，二者间差异不显著，但均显著高于除25 ℃处理外的其他温度处理，说明28～30 ℃为较适宜蜘蛛兰炭疽菌萌发的温度。综上所述，最适合蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的温度为28 ℃。

表1 不同温度对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的影响

2.2 湿度对蜘蛛兰炭疽菌分生孢子萌发的影响

由表2可知，蜘蛛兰炭疽菌分生孢子在相对湿度100 %+水滴、相对湿度100 %和90 % 3个条件下可以萌发，在相对湿度50 %～85 %条件下不萌发。其中，以100 %+水滴条件下萌发效果最佳，保湿6 h的萌发率达93.00 %，在100 %湿度下的萌发率次之，保湿6 h的萌发率为79.83 %，在相对湿度为90 %时萌发率锐减，保湿6 h的萌发率仅0.67 %，且三者间差异显著。

表2 不同湿度对蜘蛛兰炭疽菌分生孢子萌发的影响

2.3 pH对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长的影响

从图1可看出，蜘蛛兰炭疽菌菌丝在pH 3～12范围均能生长，其中最适生长的pH为5，在强酸性条件下(如pH为2时)菌丝不生长，pH大于6菌丝生长量逐渐减少，尤其是pH为12的强碱性条件下，菌丝生长量极少；差异显著性分析结果表明，不同pH处理菌丝的生长量差异显著。说明蜘蛛兰炭疽菌在弱酸性条件下生长较好。

曲线上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

2.4 碳源对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长及产孢的影响

从图2可看出，蜘蛛兰炭疽菌在供试的10种碳源培养基上均能生长，其中在D-果糖、蔗糖、D-木糖、甘露醇、D-山梨醇和可溶性淀粉培养基上生长较好，在25 ℃下培养6 d时的菌落直径分别为86.16、85.63、85.31、84.97、84.53和84.30 mm，相互间差异不显著，但均显著大于其他碳源培养基处理；在葡萄糖碳源培养基上的菌落直径也较大，为81.84 mm，显著大于在阿拉伯树胶粉、乳糖和D-麦芽糖3种碳源培养基上的菌落直径；在D-麦芽糖碳源培养基上生长最差，菌落直径仅为44.53 mm，显著低于其他碳源培养基。从图2还可看出，蜘蛛兰炭疽菌在蔗糖碳源培养基上的产孢量最多，为1.50×106个/mL，在D-麦芽糖碳源培养基上的产孢量最少，为0.83×106个/mL，在其余碳源培养基上的产孢量为1.00×106～1.33×106个/mL，但相互间差异不显著。

不同菌落直径和产孢量图柱上不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，下同

2.5 氮源对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长及产孢量的影响

从图3可看出，蜘蛛兰炭疽菌在多种氮源培养基上均能生长，其中在有机氮源酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培养基上生长最好，25 ℃培养6 d时菌落直径分别为84.81、83.54和82.23 mm，处理间差异不显著；在硫酸铵培养基上菌丝生长最慢，菌落直径仅24.97 mm，显著小于其他氮源培养基的菌落直径。从图3还可看出，蜘蛛兰炭疽菌在牛肉膏氮源培养基上的产孢量最大，达3.50×106个/mL，其次是硫酸铵培养基，产孢量达3.00×106个/mL，二者间差异不显著，但均明显大于其他氮源培养基，而在硝酸钠和甘氨酸培养基上的产孢量最小，均为1.00×106个/ mL。可见，酵母粉和牛肉膏是更适合蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长和产孢的氮源。

2.6 光照对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长及产孢量的影响

由表3可知，蜘蛛兰炭疽菌在完全黑暗、连续光照和12 h光暗交替处理中的菌落直径分别为80.91、88.12和84.04 mm，相互间差异显著，说明充足的光照能加速蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长；3种光照处理的产孢量分别为1.50×106、3.33×106和2.83×106个/mL，即连续光照处理的产孢量最大，12 h光暗交替处理次之，完全黑暗处理最小，且相互间差异显著，说明充足的光照可促进蜘蛛兰炭疽菌产生分生孢子。

表3 不同光照对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长及产孢的影响

3 讨 论

本研究结果表明，蜘蛛兰炭疽菌在10～35 ℃均能生长，当温度超过35 ℃时菌丝生长减缓，产孢量和孢子萌发率急剧减少，当温度达40 ℃时菌丝停止生长，而温度为28～30 ℃时蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢量和孢子萌发率均较高，其中最适合蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长、产孢及孢子萌发的温度为28 ℃，与董文统[6]报道海南降香黄檀炭疽病菌胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和郑肖兰等[15]报道琼中绿橙炭疽病菌(C.gloeosporioides)最适生长温度均为28 ℃的结果一致；分生孢子在饱和湿度且有水滴条件下萌发效果最佳，与廖旺姣等[14]研究发现降香黄檀苗圃或林间在4月温湿度较低时开始发病，在5-8月温湿度较高时病害迅速扩展至高峰期，9-10月连续晴天持续高温病斑扩展缓慢或不扩展的实际情况相吻合。说明影响降香黄檀炭疽病发生和流行的主要因素是苗圃或林间的温湿度，尤其是苗圃湿度高时，非常有利于炭疽病传播和蔓延。

本研究中，蜘蛛兰炭疽菌在pH 4～6范围尤其在pH为5时生长良好，与廖旺姣等[14]对降香黄檀炭疽病另一种病原菌豆类炭疽菌(C.truncatum)的研究结果一致，也与生产上调查了解到偏酸性黄壤土发生降香黄檀炭疽病危害比pH较高壤土严重的结果相符。

本研究中，不同碳源对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长和产孢具有一定影响，其中以D-果糖、蔗糖和D-木糖等为碳源的菌丝生长较好，产孢量较大，与董文统[6]的研究结果相似；而蜘蛛兰炭疽菌菌丝在D-麦芽糖培养基上生长最差，产孢量也最小，与朱英芝等[16]、王义勋等[17]报道的油茶炭疽病菌(C.gloeosporioides)生物学特性一致。在氮源利用方面，本研究中蜘蛛兰炭疽菌菌在酵母粉、牛肉膏和蛋白胨培养基上生长最好，与朱英芝等[16]的研究结果一致；在硫酸铵培养基上生长最差，即硫酸铵对蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长具有抑制作用，与江正君等[18]对漆树炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究结果一致；蜘蛛兰炭疽菌在牛肉膏培养基上产孢量最大，说明牛肉膏氮源有利于蜘蛛兰炭疽菌产孢，与王义勋等[17]对油茶炭疽病病原菌、范晓龙等[19]对南方红豆杉胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)的研究结果一致。本研究还发现，光照既可促进蜘蛛兰炭疽菌菌丝生长，也可促进产孢，与孔琼等[20]对枇杷炭疽病菌(C.gloeosporioides)的研究结果一致。

4 结 论

降香黄檀蜘蛛兰炭疽菌的菌丝生长和产孢受温度、pH、碳氮源和光照影响明显，适宜的高温和高湿有利于其病原菌分生孢子萌发。因此，生产上可根据该菌的生物学特性进行有效防控。