罗氏沼虾TRY基因生物信息学及其mRNA表达分析

2020-08-04姜建萍邱庆庆黄光华杨秀荣蒋和生杨学明蒋钦杨

西南农业学报 2020年6期

姜建萍，袁翔，邱庆庆，黄光华，杨秀荣，蒋和生，杨学明*，蒋钦杨*

(1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530004；2.广西药用植物园，广西南宁 530023；3.广西水产科学研究院，广西南宁 530021)

【研究意义】罗氏沼虾在我国淡水养殖业中占据主导地位，但存在规格不均匀、个体小型化及产量低等问题，严重制约罗氏沼虾产业的可持续发展，而亟需选育罗氏沼虾优良新品种[1]。胰蛋白酶(TRY)基因是重要的生长性状候选基因，随着分子生物学技术的快速发展，挖掘水产动物重要经济性状的候选基因，探索其生长发育的分子调控机制，将常规育种与分子育种有效地结合起来，对提高水产动物数量性状优良基因型选择的准确性及加速育种进程至关重要[2-3]。因此，开展罗氏沼虾TRY基因生物信息学分析及其mRNA表达情况研究，对深入探究TRY基因生物学功能和提高罗氏沼虾产量具有重要意义。【前人研究进展】TRY是动物体内的主要消化酶类，主要通过组氨酸残基、天冬氨酸残基和丝氨酸残基组成的催化三联体结构发挥消化作用[3]。已有研究表明，罗非鱼[5]、鳜鱼[6]、乌鳢[7]及斑节对虾[8]、中国对虾、克式原螯虾和日本对虾[9]等多种水产动物的TRY基因已被克隆获得，且众多学者对克隆获得的TRY基因相继开展了生物信息学分析，主要包括氨基酸序列比对、系统发育进化树分析、同源性分析、编码蛋白理化性质和二级结构预测等[10-13]。关于TRY基因mRNA表达在水产动物方面的研究，李运东[8]发现斑节对虾TRY基因在肝胰腺组织中显著高表达，且在整个生长阶段均有表达，但存在不同的表达模式和表达规律；马诚[11]研究认为瓦氏黄颡鱼TRY基因在其胰脏中表达最高，在肝脏中次之；李运东[8]研究发现，斑节对虾TRY基因的2个SNP位点与头胸甲长、头胸甲宽、第一腹节长和第二腹节长呈显著相关；Klein等[14-15]研究表明，TRY基因在凡纳滨对虾蜕皮过程中发挥重要作用。可见，TRY基因是重要的生长性状候选基因。【本研究切入点】目前，针对罗氏沼虾TRY基因生物信息学分析及其TRY基因mRNA表达的研究鲜见报道。【拟解决的关键问题】基于候选基因法，结合NCBI已公布的EST序列分析TRY基因生物学信息及其mRNA表达情况，为深入揭示TRY基因对罗氏沼虾生长发育的调控作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以广西南宁国家级罗氏沼虾良种场5月龄罗氏沼虾为试验材料(n=14，雌雄各半)，采集其腹部神经、胃、心脏、鳃、性腺、肝胰腺、肌肉和肠道共8个组织样品，以及生长快速家系(FG)和生长慢速家系(SG)中体重和体长极端性状的雌性罗氏沼虾肌肉组织，分别置于液氮中保存备用。

TRY基因mRNA表达所用试剂：TRIzol、反转录试剂盒和Premix ExTaqTMⅡ均购自TaKaRa公司；DL2000 DNA Marker购自广州东盛生物科技有限公司；TaqPCR MasterMix购自Vazyme公司。

TRY基因生物信息学分析所用软件：同源性比分析对使用MegAlign，系统发育进化树分析使用Lasergene v8.0，蛋白理化性质分析使用Expasy-ProParam，亲/疏水性预测分析使用ExPASy-ProtScale，二级结构预测分析使用MLRC。

1.2 总RNA提取及cDNA合成

参照TaKaRa公司的TRIzol试剂盒操作流程提取样品总RNA，RNA浓度及其完整性分别采用微量分光光度计Nanodrop 2000和1.0 %琼脂糖凝胶电泳进行检测。参照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂说明进行反转录合成cDNA。

1.3 实时荧光定量PCR分析候选基因mRNA表达

根据GenBank已公布的罗氏沼虾TRYEST序列，利用Primer 3.0和Oligo 7.0设计引物，以18S rRNA基因作为内参，引物序列见表1。实时荧光定量PCR反应体系20.0 μl：Premix ExTaqTMII 10.0 μl，cDNA 5.0 μl，上/下游引物各0.5 μl，RNase Free ddH2O 4.0 μl。扩增程序：95 ℃ 预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。

表1 实时荧光定量PCR扩增引物信息

2 结果与分析

2.1 罗氏沼虾TRY基因生物信息学分析结果

2.1.1TRY基因同源性比较及系统进化树构建根据NCBI已公布的EST序列可知，罗氏沼虾TRY基因编码266个氨基酸。同源性比较结果(图1)显示，罗氏沼虾TRY氨基酸序列与刀额新对虾(Metapenaeusensis)TRY氨基酸序列的同源性最高，与三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)TRY氨基酸序列的同源性最低。利用Lasergene v8.0构建罗氏沼虾(AMQ98968.1)、凡纳滨对虾(AEZ68613.1)、中国对虾(ACQ45454.1)、脊尾白虾(ABQ02534.1)、眼斑龙虾(ADB66713.1)、中华绒螯蟹(AKN46052.1)、三疣梭子蟹(AHJ81099.1)、刀额新对虾(ABQ02531.1)和拟穴青蟹(AGO02163.1)的氨基酸序列系统发育进化树，结果(图2)显示，罗氏沼虾和刀额新对虾的遗传距离最近，与凡纳滨对虾的遗传距离最远，说明罗氏沼虾与刀额新对虾的亲缘关系最近，与凡纳滨对虾的亲缘关系最远。

图1 罗氏沼虾TRY氨基酸序列与其他水产动物TRY氨基酸序列的同源比对分析结果

图2 基于TRY蛋白氨基酸序列相似性构建的系统发育进化树

2.1.2 TRY蛋白理化性质和结构预测经ProtParam在线预测分析得知罗氏沼虾TRY蛋白的分子量为28.54 kD，理论等电点为4.44；甘氨酸(Gly)含量较高，占总氨基酸含量的11.7 %；带正电荷的氨基酸残基(Arg+Lys)为32个，带负电荷的氨基酸残基(Asp+Glu)为12个，不稳定系数为27.62，脂肪数为81.39，亲水性平均值为0.027。罗氏沼虾TRY蛋白亲/疏水性预测分析结果如图3所示，TRY蛋白具有一定的疏水性。TRY蛋白二级结构预测结果显示，罗氏沼虾TRY蛋白二级结构中α-螺旋占17.67 %，延伸链占21.05 %，无规则卷曲占61.28 %。

图3 罗氏沼虾TRY蛋白的亲/疏水性预测分析结果

2.2 TRY基因的mRNA表达分析

2.2.1TRY基因的组织表达谱分析从图4可看出，TRY基因在雄性罗氏沼虾组织中的表达量以肝胰腺最高，其次为胃、心脏、肠道、腹节神经、鳃、精巢和肌肉；在雌性罗氏沼虾组织中的表达量也以肝胰腺最高，其次为肠道、卵巢、胃、腹节神经、心、肌肉和鳃。其中，在雄性个体胃、心脏和肝胰腺中的表达量极显著(P<0.01，下同)或显著(P<0.05)高于雌性个体，在性腺中的表达量极显著低于雌性个体，在腹节神经、鳃、肌肉和肠道中的表达量差异不显著(P>0.05)。初步推测TRY基因在罗氏沼虾中可能存在性别表达特异性。

雄性和雌性罗氏沼虾胃、心脏、性腺和肝胰腺图柱上的**表示差异极显著(P<0.01)，*表示差异显著(P<0.05)

2.2.2TRY基因在不同生长速度家系个体的表达规律分析以本研究课题组前期采集FG和SG中体重和体长极端表型雌性罗氏沼虾的肌肉组织为试验材料(n=8)，进一步探究TRY基因在不同生长速度个体中的表达规律，结果(表2)表明，FG中个体的体重、体长、头胸甲长、头胸甲宽、腹节长和腹节宽等表型值均极显著大于SG中的个体。

表2 16尾FG和SG雌性罗氏沼虾个体的表型值比较

实时荧光定量PCR分析结果(图5)显示，TRY基因在FG个体肌肉组织中的表达量极显著高于在SG个体肌肉组织中的表达量，且在FG个体中的表达量是SG个体中表达量的7.63倍。说明TRY基因在罗氏沼虾生长发育过程中发挥了重要作用。

罗氏沼虾FG个体肌肉组织图柱上的**表示差异极显著(P<0.01)

3 讨论

TRY属丝氨酸蛋白酶家族，其主要功能是消化蛋白质食物和活化所有胰腺分泌的酶原[14-16]，主要作用于靶蛋白的精氨酸或赖氨酸羧基端的肽键[17]。相关研究表明，TRY作为重要的蛋白消化酶类，与小龙虾能量供应和生长所需的氨基酸代谢相关[18]，且与体型呈正相关，能解释体型大小68 %的遗传变异[19]。在大西洋鲑鱼中的研究发现，TRY显著影响游离氨基酸的吸收与转运，其蛋白消化速率和游离氨基酸吸收效率与肌肉中的蛋白合成速率呈正比[20]。以上研究均表明，TRY与水生动物的生长发育显著相关。本研究选取TRY基因作为罗氏沼虾生长性状候选基因进行深入研究，并基于NCBI已公布的EST序列，对罗氏沼虾TRY基因进行生物信息学分析，同源性比对结果和系统进化树分析结果均显示，罗氏沼虾TRY氨基酸序列与刀额新对虾的同源性最高，即罗氏沼虾与刀额新对虾的亲缘关系最近。

虾蟹类动物的TRY主要由肝胰腺分泌[21]，而肝胰腺作为虾类的主要物质代谢器官，在各种消化酶类合成、分泌及营养物质吸收、消化和能量储存等方面扮演重要角色[22]，是影响甲壳类动物生长的重要器官[23-24]。本研究发现，TRY基因在雌雄罗氏沼虾肝胰腺组织中高表达，与李运东[8]对斑节对虾的研究结果一致；TRY基因在雌性和雄性罗氏沼虾个体的胃、心脏、肝胰腺和性腺中的表达水平存在极显著或显著差异，推测该基因可能存在性别表达特异性，与詹湉湉[25]、许丽惠等[26]研究认为TRY基因在黄羽肉鸡各组织中广泛表达且在雌、雄黄羽肉鸡的胰腺组织中表达量最高及不同发育阶段、不同组织的TRY基因均存在性别差异性的观点吻合。

本研究结果表明，FG中个体的体重、体长、头胸甲长、头胸甲宽、腹节长和腹节宽等表型值均极显著大于SG中的个体。TRY基因在FG个体肌肉组织中的表达极显著高于SG个体，与前人研究认为斑节对虾的TRY基因表达量在幼体和仔虾期很低，但随着幼体的发育表达量逐渐升高[8]、随着黄颡鱼的生长发育，TRY基因的表达逐渐升高[27-28]及随着凡纳滨对虾幼体的不断发育，其TRY活力逐渐升高[29]的观点相似。因此证实，TRY基因在罗氏沼虾生长发育过程中发挥了重要作用，推测TRY基因表达量高的FG个体，其TRY活性相应也较高，因而生长速率快，与Ueberschar[30]研究认为大西洋鲑的TRY活性与生长速率呈明显正相关、TRY活性可作为衡量其生长速率重要指标的观点一致，进一步提示TRY基因可能通过肝胰腺组织介导并调控罗氏沼虾的生长发育。