西藏河谷区紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体的筛选

田 丽，王富强，汤继旺，叶彦辉,2，陈文峰，金 涛，彭 君，邵小明*

(1.中国农业大学资源与环境学院/生物多样性与有机农业北京市重点实验室，北京 100193；2.西藏农牧学院，西藏 林芝 860000；3.中国农业大学根瘤菌研究中心，北京 100193；4.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏 拉萨 850009；5.西藏自治区农牧科学院农业研究所，西藏 拉萨 850032)

【研究意义】西藏是青藏高原的主体，平均海拔4000 m以上，素有“世界屋脊”和“地球第三极”之称，是青藏高原生态安全屏障的核心区域[1]。但近几十年来，青藏高原作为全球气候变化的敏感区之一，加之西藏生产、旅游等人为活动的加强，以及对牲畜需求的稳定增长，导致西藏草地退化严重，草畜矛盾明显增加[2]。推广人工牧草种植已经成为缓解这一矛盾的有效途径，也是西藏自治区政府重点关注的民生工程之一[3]。在人工牧草种植中，豆科植物一直是牧草中的重要类群，它不仅可以饲草，还可以通过共生固氮来获取空气中的N，增加土壤肥力，提升豆科牧草的产量和营养品质[4]。西藏主栽的多年生豆科牧草紫花苜蓿(Medicagosativa)分布广，不同海拔、不同气候类型下紫花苜蓿的生长状态各不相同，如何通过接种根瘤菌以减少化肥投入并提高产量？根瘤菌是一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，它能侵染豆科植物的根部形成根瘤，将大气中分子态氮转化成植物可吸收利用的化合态氮，作为回报，根瘤菌可在受保护的环境中获得碳水化合物[5]。根瘤菌与其寄主植物之间平衡稳定的内生联系为提高寄主植物在植物生命周期中的表现提供了一种可持续的途径[6]。研究表明，紫花苜蓿与根瘤菌不同菌株间具有一定的选择性[7]，同一菌株接种不同的紫花苜蓿品种，或同一品种用不同菌株接种，都会出现不同的共生效果，而且彼此差异较大[8]。另外，任何对根瘤菌或寄主植物的生长发育产生负面作用的环境因子，诸如温度、降水、土壤养分、盐碱度、含水量、pH等都可能对共生固氮产生影响[9-10]。【前人研究进展】国内外有关紫花苜蓿和根瘤菌的研究已有很多报道[11-14]，但西藏的根瘤菌研究仅限于采集、分类等[15]，对于不同区域是否需要不同菌株以达到减肥增效作用尚未有报道。西藏地域辽阔，不同地区海拔、气候、土壤等条件差异较大，而同种根瘤菌在不同地区的固氮效果往往存在较大差异。【本研究切入点】为了筛选出适合西藏河谷区的紫花苜蓿-根瘤菌高效共生体，本研究在西藏的林芝、拉萨、日喀则3地开展了紫花苜蓿与5个苜蓿中华根瘤菌菌株的田间匹配试验。【拟解决的关键问题】以期为西藏不同气候下紫花苜蓿的高效生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

林芝试验地位于林芝市巴宜区八一镇唐地村(94°21′E，29°41′N，海拔2900 m)，属温暖湿润季风气候。年平均气温8.8 ℃，最冷月平均气温为-2 ℃，最热月平均气温20 ℃，无霜期160～180 d，年日照时数2022 h，年平均降水量650～750 mm，主要集中在5-9月份，占全年降水量的90 %左右。土壤母质主要是冲积、洪积母质，质地偏沙，土质较好。

拉萨试验地位于拉萨市达孜县章多乡曲尼巴村(91°36′ E，29°48′ N，海拔3744 m)，属高原温带半干旱季风气候。年平均气温7.5 ℃，最高气温28.1 ℃，最低气温-16.5 ℃，无霜期100～120 d左右，年降水量为450 mm，主要集中在6-9月份，全年日照时数3000 h以上，太阳辐射强，昼夜温差大，冬春寒冷干燥且多风。试验地土壤为砂壤土，质地较松散。

日喀则试验地位于日喀则市拉孜县曲下镇拉曲村(87°38′E，29°07′N，海拔3970 m)，属高寒干旱气候。年平均气温6.9 ℃，最高气温为25.6 ℃，最低气温为-16 ℃，无霜期226 d，年降水量为329.9 mm，其中6-9月降水量占全年的90 %以上。气候干旱少雨，夏凉，冬寒，日照强烈，冬春季少雨雪多大风，风力较大，持续时间长。试验地土壤为砂石土，质地较粗，土层较薄，保水和保肥能力差，蒸发量极大。

各试验地土壤理化性质见表1。

表1 试验地土壤理化性质

1.2 试验材料

从表2可知，供试植物：中兰2号紫花苜蓿(Medicagosativa‘Zhonglan No.2’)，净度96 %，发芽率(86±3) %，适应性强，在西藏3个地点都生长良好，由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所提供；供试菌株：苜蓿中华根瘤菌(液体型)，由中国农业大学菌种保藏管理中心(Culture Collection of Beijing Agricultural University,CCBAU)提供。

表2 供试菌株及采集地

1.3 小区设计及管理

试验分别于2018年5月29日、6月1日、6月5日在林芝、拉萨、日喀则无紫花苜蓿种植史的试验地进行。以5株苜蓿中华根瘤菌为研究材料对中兰2号紫花苜蓿进行田间小区试验，以不接种根瘤菌的处理为对照(CK)，采用随机区组试验设计，每个处理3个重复，共54个小区，小区面积为8 m × 10 m，间隔0.5 m。播种前深耕，采用人工条播的方式播种，播深2～3 cm，行距25 cm，播种量为15 kg/hm2。在需要接种根瘤菌的紫花苜蓿小区中，播种前用含活菌数不少于109mL-1液体菌剂充分拌种；在生长期根据实际情况适当除草、灌溉，并于2018年10月5日、10月8日、10月12日对林芝、拉萨、日喀则3个地区进行取样。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 牧草产量 分别在3个地区的试验小区选取生长较为均匀区域，随机沿行方向选出1 m长的样带，用剪刀离地面约5 cm剪取紫花苜蓿，去除杂草后称鲜重。将称完的鲜草带回实验室在105 ℃条件下杀青30 min，然后在80 ℃条件下烘干至恒重并测量干重。

1.4.2 土壤理化性质 在各试验小区中，利用土壤取样器进行表层土(0～15 cm)取样。每个小区各取5钻，然后将土壤混合作为该小区的土样。将土壤样品带回实验室后，在阴凉通风条件下阴干磨细，收集保存，用于测定土壤理化性质。其中，土壤pH采用电位法测定，土壤全氮含量采用凯氏定氮法测定[16]，铵态氮含量采用凯氏半微量定氮法测定[17]，硝态氮含量采用紫外分光光度法测定[17]。

1.5 数据处理

采用Excel 2010进行数据整理，运用SPSS 20.0进行单因素方差分析(one-way ANONA)，用最小显著性差异法(Least-Significant Difference,LSD)进行多重比较，采用GraphPad Prism 8作图。

2 结果与分析

2.1 个试验地各菌株接种效果比较

牧草产量是反映接种效果的一个重要指标。由图1表明，在不同地区接种根瘤菌不同菌株对中兰2号紫花苜蓿产量的影响是不同的。

不同字母表示同一地区不同处理间差异显著(P<0.05)

在林芝地区，中兰2号接种根瘤菌CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU01290和CCBAU85104的处理与CK相比显著提高了紫花苜蓿的鲜、干草产量(P<0.05)，其中干草产量分别增产130.2 %、113.7 %、101.6 %、97.4 %，而处理CCBAU85213与对照相比无显著差异(P>0.05)。因此，在林芝试验地中，根瘤菌CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU01290和CCBAU85104均可达到增产效果，且根瘤菌CCBAU85240接种效果最好。

在拉萨地区，中兰2号接种根瘤菌CCBAU01290、CCBAU85104、CCBAU85240和CCBAU85109的处理与CK相比显著提高了紫花苜蓿的鲜、干草产量P<0.05)，其中干草产量分别增产92.7 %、87.0 %、53.1 %、40.3 %，而处理CCBAU85213与对照相比无显著差异(P>0.05)。因此，在拉萨试验地中，根瘤菌CCBAU01290和CCBAU85104能够与中兰2号高效共生，并实现显著增产(P<0.05)。

在日喀则地区，中兰2 号接种根瘤菌CCBAU85213、CCBAU85104的处理与CK相比显著提高了紫花苜蓿的鲜、干草产量(P<0.05)，其中干草产量分别增产225.2 %、79.8 %，而处理CCBAU01290、CCBAU85109和CCBAU85240与对照相比无显著差异(P>0.05)。因此，在日喀则试验地中，根瘤菌CCBAU85213最适应当地的气候和环境，与中兰2号形成了较好的互利共生关系，促进其生长。

2.2 接种根瘤菌对土壤理化性质的影响

2.2.1 接种各菌株对林芝地区土壤理化性质的影响 从表3可知，在林芝地区接种各菌株后，处理CCBAU85104、CCBAU85240、CCBAU85109、CCBAU8 5213的全氮含量与CK相比均显著增加(P<0.05)，增幅在28.5 % ～ 70.8 %；土壤铵态氮含量在组间无显著差异(P>0.05)；在土壤硝态氮指标上，处理CCBAU01290显著高于CK(P<0.05)，其他各组间无显著差异(P>0.05)；在含水量指标上，处理CCBAU85104、CCBAU01290显著高于CK(P<0.05)；在pH指标上，除处理CCBAU85213外，其他各组间无显著差异(P>0.05)。

表3 林芝地区接种根瘤菌后土壤理化性质变化

2.2.2 接种各菌株对拉萨地区土壤理化性质的影响 从表4可知，在拉萨地区接种各菌株后，所有处理根际土壤全氮含量与CK相比均显著增加(P<0.05)；在铵态氮指标上，处理CCBAU01290显著高于CK(P<0.05)，其他各组间无显著差异(P>0.05)；在硝态氮指标上，处理CCBAU85240、CCBAU85109显著增加(P<0.05)，其他各组间无显著差异(P>0.05)；在含水量指标上，各组间无显著差异(P>0.05)；在土壤pH指标上，处理CCBAU85213、CCBAU85240、CCBAU01290显著高CK(P<0.05)。

表4 拉萨地区接种根瘤菌后土壤理化性质变化

2.2.3 接种各菌株对日喀则地区土壤理化性质的影响 从表5可知，在日喀则地区接种各菌株后，根际土壤全氮含量在各组间差异显著(P<0.05)，组间排序为CCBAU85213>CK>CCBAU85240> CCBAU85109> CCBAU85104> CCBAU01290，其中处理CCBAU85213高于CK 20 %；在铵态氮指标上，除处理CCBAU85213显著高于CK(P<0.05)外，其他各组间无显著差异(P>0.05)；在硝态氮含量上，处理CCBAU85109、CCBAU85240显著高于CK(P<0.05)，其他处理间无显著差异(P>0.05)；在含水量指标上，所有处理与CK相比均显著增加(P<0.05)，是CK的1.97～5.53倍；在土壤pH指标上，除处理CCBAU85213显著低于CK(P<0.05)外，其他处理与CK相比无显著差异(P>0.05)。

表5 日喀则地区接种根瘤菌后土壤理化性质变化

试验结果表明，接种高效根瘤菌能显著提高土壤全氮含量(P<0.05)，但对铵态氮、硝态氮和pH无显著影响。日喀则地区气候恶劣、土壤贫瘠，较林芝、拉萨而言接种根瘤菌后各菌株表现差异较大，除CCBAU85213菌株外，接种根瘤菌在不同程度上降低了土壤全氮含量。可见，在环境恶劣的地区，接种高效根瘤菌的作用会更加明显。

2.3 影响中兰2号牧草产量的相关性分析

从表6可知，对3个试验点的平均温度(6-10月份)、平均降水(6-10月份)、干草产量、土壤全氮、铵态氮、硝态氮、含水量、pH等指标进行相关性分析。温度、土壤含水量和土壤pH与其他指标间均存在显著相关关系(温度与土壤全氮的关系除外)；干草产量与温度、土壤含水量呈正相关关系，与土壤pH呈负弱相关关系。由此可见，温度、土壤含水量和pH在很大程度上影响了苜蓿产量和土壤中的氮素含量。

表6 中兰2号接种根瘤菌各指标的相关性分析

3 讨 论

3.1 不同菌株在不同土壤环境下接种效果的比较

本试验是在实验室前人的工作基础上选择了5株采集自西藏或内蒙、结瘤能力、固氮能力、竞争能力强的高效根瘤菌菌株[18-19]。但是，3个地点的接种试验表明，这5个菌株对中兰2号紫花苜蓿的促生效果在不同地区表现不同。在林芝、拉萨、日喀则3个试验地与中兰2号紫花苜蓿最佳匹配的根瘤菌依次为：CCBAU85240、CCBAU01290和CCBAU85104、CCBAU85213。而且，在这3个土壤养分以及气候条件有较大差异的种植环境中，筛选得到的最佳匹配菌株也各不相同，说明菌株受到环境的显著影响，不同地区需要不同根瘤菌菌株。闫伟[20]在沙尔沁、海流图、观碾房3个试点区的根瘤菌田间筛选试验中表明这3个地区与草原3号杂花苜蓿相匹配的根瘤菌分别是SJN、XT、HBH。这与本研究的所得的结论是一致的。

苜蓿和根瘤菌的共生关系受到寄主、根瘤菌和环境三因素共同影响，而不只是根瘤菌与苜蓿的相互对话[21]。因此，为了获得最佳的增产效果，根瘤菌选用时需针对种植的生态环境和寄主植物两方面因素选择最佳匹配的根瘤菌[22-23]，只考虑与寄主关系很可能是田间接种效果不稳定的主要原因[24]。

此外，菌株CCBAU85213采集自日喀则，与其他菌株相比，更能适应其高寒干旱的气候和相对贫瘠的土壤条件，能够与中兰2号高效共生，实现显著增产。可见，在选择针对某一地区的根瘤菌时，最有效的还是来自本区或条件相近的菌株。这一结果在对大豆和紫花苜蓿的相关研究中也得到了相同的结论[25-26]。

值得注意的是，在日喀则地区表现最佳的菌株CCBAU85213在林芝、拉萨地区虽然没有起到显著增产的作用，但也说明在选择根瘤菌剂时要注意菌株的地域适应性，在某一地区表现优异的菌株并不一定适合于其他地区，尤其是在不同地区气候、土壤条件差异明显的青藏高原，因此关于这一方面仍需开展深入研究。

3.2 影响接种效果的环境因素

根瘤菌与豆科植物之间的相互作用由于不利的土壤和气候等因素而变得复杂。温度、降水、土壤养分、盐碱度、含水量、pH值等因素的波动对土壤微生物和植物的生长、存活和代谢活动及其共生能力有很大的影响[9]。相关性分析(表6)显示，温度、土壤含水量和pH在很大程度上影响了苜蓿产量和土壤中的氮素含量。研究表明，温度是影响豆科植物生长、存活、结瘤和固氮的主要因素之一。一般而言，苜蓿根部温度在22 ℃时，结瘤效果最好[27]；土壤水分也是影响固氮生物生理活动的重要因素，Serraj R[28]等人的研究表明，豆科植物-根瘤菌共生关系的形成及其活性对干旱十分敏感。当土壤水分严重缺乏时，固氮酶活性下降80 %～85 %[27]，从而抑制苜蓿-根瘤菌共生体系结瘤固氮，影响氮素的积累、降低植株高度和牧草产量[29-30]；土壤pH对苜蓿-根瘤菌的固氮效率有显著影响，过高或过低的pH值都会对根瘤菌的生长有抑制作用，根瘤菌生长最适的pH 6.5～7.5[31-32]。苜蓿根瘤菌一般不耐酸，酸性土壤会降低根瘤菌与宿主植物之间的亲和性，抑制根瘤菌的存活，从而使生物固氮受阻[32]；土壤环境中较高浓度的化合态氮(主要为硝态氮和铵态氮)会影响根瘤菌对根毛的侵染，降低结瘤数量，从而对其固氮效率表现出明显抑制作用[27]。

林芝地区温暖湿润，养分较好，但其牧草产量却不是最高的，可能是由于紫花苜蓿更喜温暖半干旱气候，且其最适pH 7～8[33]，而较强的土壤酸度和较高的氮素含量，在一定程度上了抑制了结瘤，降低了紫花苜蓿-根瘤菌共生体系的固氮效率和生物量；拉萨地区属高原温带半干旱气候，土壤偏中性，氮素含量较低，在接种根瘤菌后显著提高了苜蓿产量，成为最高产的地区，说明在氮素营养缺乏的条件下接种根瘤菌是十分必要的；日喀则地区高寒干旱，盐碱土质，土壤肥力差，除菌株CCBAU85213外，其他菌株并未表现出对中兰2号明显的促生作用，平均产量最低。可能是由于试验地气候干旱，蒸发量大，降低了水的活性，提高了植物根部渗透压或加强了盐胁迫[34]，从而抑制根瘤呼吸及光合作用产物向根瘤菌的供应以及根瘤菌的固氮活性和植物生长[24]。因此，如果限制因素限制了寄主豆科植物的活力，那么竞争和持久的根瘤菌株也将不能充分表达其固氮活性[35]。

此外，研究结果还发现，高效根瘤菌菌株接种后，在生长季中可提高土壤全氮含量。在林芝、拉萨和日喀则地区接种表现最佳的菌株CCBAU85240、CCBAU01290和CCBAU85104以及CCBAU85213与CK相比显著提高了土壤全氮含量，但速效氮、含水量和pH有增有减。可能是由于固定的氮素以及脱落的根瘤和凋落物增加了土壤全氮含量，而铵态氮和硝态氮可被植物吸收利用，导致土壤中速效氮含量增加不显著。闫伟[20]的研究表明，接种根瘤菌对碱解氮有显著提高，但对全氮含量无显著影响。虽然这一结论与本研究并不一致，但都表明：在不同土壤环境中接种根瘤菌不仅对植物的共生固氮有直接作用，还会引起土壤微生物群落结构的改变，从而间接影响微环境。

4 结 论

紫花苜蓿-根瘤菌共生体系发挥高效共生作用受寄主、根瘤菌和环境的综合影响。同一寄主植物在不同地区接种同一根瘤菌，其促生效果可能完全不同。

与中兰2号紫花苜蓿最佳匹配的菌株：林芝地区是CCBAU85240，拉萨地区是CCBAU01290和CCBAU85104，日喀则地区是CCBAU85213。

相匹配的根瘤菌菌株接种后，在生长季中可提高土壤全氮含量。由此可见，在高寒区对紫花苜蓿接种高效根瘤菌可有效增加土壤肥力，对西藏人工草地建植、天然草地恢复具有重要意义。