不同方法提取雄蚕蛾蛋白质及提取工艺的优化

肖潇，周晓玲，陆呈宏，陆春霞，刘开莉，梁贵秋

（广西壮族自治区蚕业技术推广站，南宁市530007）

长久以来，肉类一直是人们获取蛋白质主要来源，蛋白质资源短缺一直是当今社会存在的普遍问题[1]。又由于传统蛋白质市场中存在着卫生、环境污染、动物福利等问题，使得消费者对替代蛋白质食品的兴趣日益增加。替代蛋白质产品主要有3大类：植物蛋白、昆虫蛋白、人造肉，其中昆虫蛋白在食物转化率、蛋白含量、生长速度、环保、可工业化生产等方面都优于其余两者[2]。我国民间食用蚕蛹历史悠久，蚕蛹也被记载为医食同源的昆虫。蚕蛾作为蚕种生产后的副产物，因繁衍需要累积了大量蛋白质等营养成分。蚕蛾蛋白质含量高达45.74%，氨基酸组成丰富[3]，是一种经济且高质量的蛋白资源[4]。此外，蚕蛾蛋白中含有丰富的抗菌肽、防御素、免疫蛋白、凝集素等活性肽物质，还可以开发成药品、保健品[5]等。

目前提取昆虫蛋白的主要方法是抽提法，包括碱法、盐法、有机溶剂法、Tris-HCl法、酶解法等[6]，其中碱法的蛋白质提取率高、成本低，但碱浓度过高时易产生有害物质。盐法能保留蛋白质活性成分，但提取效率较低。有机溶剂法和Tris-HCl法可以提取与脂质紧密结合的蛋白质，但成本高，易残留[7]。酶法温和，能最大保留蛋白的营养价值，但易产生苦味，而且不适用未脱脂的样品[8-9]。因此本文选择盐法和碱法提取雄蚕蛾蛋白质。

为了避免获取的雄蚕蛾蛋白残留有机溶剂，采用不脱脂的雄蚕蛾干粉为提取对象。由于未找到雄蚕蛾蛋白质组成成分的记载，参照蚕蛹的蛋白质组成，由练钊等[10]对蚕蛹的4种蛋白分离提取所知，蚕蛹的蛋白组成主要为清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白，其中清蛋白和谷蛋白总体占蚕蛹蛋白质量约96%，等电点均在pH 3.9，球蛋白等电点在pH 2.8，而清蛋白的溶解性和持水性最强，谷蛋白的疏水性最强。本研究在此基础上，根据蚕蛹蛋白质的特点，设计盐法和碱法的试验方案。盐法提取蛋白试验中，添加的中性盐离子破坏了蛋白质分子周围的水化膜，使之盐析出来，不同蛋白质的等电点不一，析出的先后不同。盐法中以水为溶剂，主要用于提取清蛋白、球蛋白，利用低浓度NaCl溶液溶解蛋白，高浓度（NH4）2SO4溶液在等电点将目标蛋白析出。碱法提取蛋白试验中，NaOH可以破坏蛋白质的次级键和氢键，使之溶解，主要用于提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白。蚕蛹蛋白中碱性蛋白占19.73%[11]，提取率受碱浓度影响，碱浓度过低蛋白质不易溶解，过高使蛋白变性，有臭味。李健[11]用碱法提蚕蛹蛋白，发现蛋白质提取率影响因素的影响程度依次为提取温度＞液固比＞pH＞提取时间。

1 材料和方法

1.1 试验材料和试剂

样品：选用两广二号家蚕品种的未交配雄蚕蛾，由广西蚕业技术推广站提供；

试剂：Bradford蛋白质浓度测定试剂盒，购于上海碧云天生物技术有限公司；NaOH、NaCl、（NH4）2SO4皆为食品级试剂；14 KD标准等级透析袋，购于上海BBI生命科学有限公司。

仪器：RT6500全自动酶标仪，由深圳雷杜生命科学股份有限公司生产；HC-2518高速离心机，由安徽中科中佳科学仪器有限公司生产；SHZ-A水浴恒温振荡器，由上海博迅实业有限公司医疗设备厂生产；DFT-200A手提式中药高速粉碎机，由温岭大德药机有限公司生产；DHJ-9140（A）鼓风干燥箱，由上海一恒科学仪器有限公司生产；PHSJ-5精密酸度计，由上海雷磁仪电科学仪器有限公司生产；ESJ-B电子分析天平，由沈阳龙腾电子有限公司生产。

1.2 雄蚕蛾粉末的制备

提取样品采用两广二号刚羽化1 h的雄蚕蛾，依次经过以下程序：清洗，沥干，60℃烘干2 d，取2 g样品按照标准GB 5009.3-2016直接干燥法测含水量，重复3次测定，去翅膀，打磨成粉，-20℃冷冻储存。

1.3 蛋白质的提取方法

1.3.1 盐提蛋白质方法 按照单因素试验设计，取0.5 g样品分别加入10 mL的EP管中，每个EP管加入1 mL 4℃预冷的0.1 mol/L Na3PO4溶液。加入5 mL按照单因素试验设计的NaCl溶液，再将样品放置在40℃水浴锅中4 h，期间时不时晃动EP管。将盐溶解的样品于6℃冷藏沉淀2 h后于10 000 r/min离心15 min，取20 mL上清液于EP管中，用0.1 mol/L HCl和0.1 mol/L NaOH调节PH至3.9，用20%（NH4）2SO4进行沉淀2 h，将所得的沉淀经4 000 r/min离心，转移至5 mL的EP管中，再调节pH至2.8，用40%（NH4）2SO4进行沉淀2 h，将所得的沉淀经4 000 r/min离心，转移至5 mL的EP管中，用Bradford法测定蛋白质浓度，计算蛋白质含量。所得粗蛋白经透析去盐，再经50℃烘干至恒重，测定蛋白质提取率。

1.3.2 碱提蛋白质方法 方法同盐提蛋白法处理，按照单因素试验设计加入5 mL的NaOH溶液，再将样品放置在50℃水浴锅中3 h。将碱溶解的样品经冷藏沉淀，用中性盐盐析提取蛋白，处理方法同上。

1.3.3 盐提蛋白质的单因素实验设计 分别对盐浓度、料液比（g/mL）、提取温度、提取时间进行调整，进行单因素试验。每个因素设置5个梯度，重复3次。盐浓度设定为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时，料液比（g/mL）为1∶10 g/mL，提取温度为40℃，提取时间为4 h；料液比（g/mL）设定为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 g/mL时，盐浓度为1.0%，提取温度为40℃，提取时间为4 h；提取温度设定为20℃、30℃、40℃、50℃、60℃时，盐浓度为1.0%，料液比（g/mL）为1∶10 g/mL，提取时间为4 h；提取时间设定为2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 h，盐浓度为1.0%，提取温度为40 ℃，料液比（g/mL）为1∶10 g/mL。

1.3.4 碱提蛋白法的单因素实验设计 分别对碱浓度、料液比（g/mL）、提取温度、提取时间进行调整，进行单因素试验。每个因素设置5个梯度，重复3次试验。碱浓度设定为0.8%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%时，料液比（g/mL）设定为1∶10，提取温度为50℃，提取时间3 h；料液比（g/mL）设定为1∶5、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL时，碱浓度为2.0%，提取温度为50℃，提取时间3 h；提取温度分别设定为40℃、50℃、60℃、70℃、80℃时，碱浓度为2.0%，料液比（g/mL）1∶10，提取时间3 h；提取时间设定为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h时，碱浓度为2.0%，料液比（g/mL）1∶10 g/mL，提取温度为50℃。

1.3.5 盐法提雄蚕蛾蛋白质的正交试验设计 通过之前盐提蛋白法的单因素实验确定两种方法的最佳试验参数范围，再通过正交试验设计，以蛋白质提取率为指标，选择4个影响因素：盐浓度、料液比（g/mL）、提取温度、提取时间，选择3个水平，确定为L9（34）正交实验的因素与水平情况如表1。

表1 盐法提雄蚕蛾蛋白正交试验因素水平表

1.3.6 碱法提雄蚕蛾蛋白质的正交试验设计 通过之前碱法提蛋白质的单因素实验确定该提取方法的最佳试验参数范围，再通过正交试验设计，以蛋白质提取率为指标，选择4个影响因素：碱浓度、料液比（g/mL）、提取温度、提取时间，选择3个水平，确定为L9（34）正交实验的因素与水平情况如表2。

表2 碱法提雄蚕蛾蛋白正交试验因素水平表

1.3.7 复合盐法—碱法提取蛋白质方法 取0.5 g样品加入10 mL的EP管中，再加入预冷的4℃的0.1 mol/L Na3PO4溶液1 mL。加入一定浓度NaCl溶液，按照所得盐法最优反应条件提取蛋白质，再加入一定浓度NaOH溶液，按照碱法最优反应条件提取蛋白质，期间时不时晃动EP管。将所得蛋白质溶解液经冷藏沉淀，再用中性盐析出，方法同盐提蛋白法，用Bradford法测定蛋白质浓度，计算蛋白质含量。所得粗蛋白经透析去盐，再经50℃烘干至恒重，计算蛋白质提取率（每个样品平行3次）。

1.4 蛋白质纯度与提取率的测定

蛋白质提取率按照公式1计算。

蛋白质纯度测定：参照Bradford法试剂盒说明书，以牛血清蛋白（20 mg/mL）为标准液，加入G-250染色液，于波长595 nm处测吸光度，绘制标准曲线，将待测样品的吸光度带入标准曲线中比较可得。

[X=待测蛋白质量/μ g；n=稀释倍数；m=样本质量/g；V1=样本液体总体积/mL；V2=检测用样品体积/mL]

待测样品为提取的粗蛋白样品取1 mL稀释20倍，再取10μ L加入300μ L的染色液混匀。静置10 min后上样。

空白对照样品为10μ L蛋白稀释液。

标准曲线的蛋白质上样量如表3，标准曲线的绘制见图1。

表3 牛血清蛋白标准曲线测定

2 结果与分析

按照直接干燥法测定样品的含水量在（3.860±0.205）%之间。

2.1 盐法单因素试验结果

以提取率为标准，得到盐浓度、料液比（g/mL）、提取时间、提取温度与提取率的关系如图2、3、4、5所示。由图2可得，蛋白质提取率随着盐浓度增加而先上升后降低，在盐浓度达到2%时蛋白质提取率达到最大值41.97%。主要因为蛋白质在稀盐溶液中发生盐溶现象，中性盐离子被吸附在蛋白质表面，带电层使得蛋白质分子间分离，另一方面盐离子使蛋白质与水分子结合更紧密。但当盐离子的浓度达到一定量时，大量的自由水结合盐离子变成了结合水，使得蛋白质表面的疏水基被暴露出来，疏水作用使蛋白质聚集沉淀，因此蛋白质提取率降低[12]。而雄蚕蛾蛋白质中的清蛋白和球蛋白能溶于水、稀酸液、稀碱液，用一定浓度的（NH4）2SO4在等电点可析出。由此选择盐浓度1.5%、2.0%、2.5%为盐法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图3可得，蛋白质提取率随着料液比（g/mL）稀释而先上升后降低，在料液比（g/mL）达到1∶10时蛋白质提取率达到最大值43.1%。主要因为料液比（g/mL）太低，溶液太浓，蛋白质不能得到充分溶解；但料液比（g/mL）大于一定范围时，水溶性蛋白的损失增加，并且生产成本提高[12]。由此选择料液比（g/mL）1∶5、1∶10、1∶15为盐法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图4可得，蛋白质提取率随着提取温度的增加而先上升后下降，在提取温度达到40℃时达到最大值47.33%。主要因为随着温度升高，蛋白质溶解速率加快；但当温度超过一定值时，会造成蛋白质的变性，部分水解为氨基酸，部分不能溶解，从而使提取率降低。由此选择提取温度为30℃、40℃、50℃为盐法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图5可得，蛋白质提取率随着提取时间增加而先上升后下降，在提取时间达到4 h时达到最大值38.33%。主要因为随着提取时间的增加，蛋白质能够充分溶解在盐溶液中；但水分也随着时间的延长而持续挥发[13]，当提取时间高于一定范围，固液比大于一定值，蛋白质的溶解率降低，提取率减小。由此选择提取时间为3.5 h、4.0 h、4.5 h为盐法提取雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

2.2 碱法单因素实验结果

以提取率为标准，得到碱浓度、料液比（g/mL）、提取时间、提取温度与提取率的关系如图6、7、8、9所示。由图6可得，蛋白质提取率随着碱浓度的增加而一直上升，当碱浓度达到2.0%时，提取率达到最大值55.13%。主要因为蚕蛾蛋白质中碱性蛋白较多，随着碱浓度增加溶解率增加；但当碱浓度超过一定值蛋白质发生“胱赖反应”，部分蛋白质变性，还会产生有毒有色物质，也不适宜食用[14]。而碱浓度过高时调节等电点需要大量HCl溶液中和，从而使得提取液中盐浓度过高，蛋白质溶解率降低，则蛋白质提取率降低。由此选择碱浓度为1.5%、2.0%、2.5%为碱浓法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图7可得，蛋白质提取率随着料液比（g/mL）的减小而先上升后下降，当料液比（g/mL）达到1∶8时，提取率达到最大值54.2%。原因与盐法提取蛋白质的料液比（g/mL）影响相同，由此选择料液比（g/mL）为1∶5、1∶8、1∶10为碱法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图8可得，蛋白质提取率随着温度的升高而先上升后下降，当提取温度达到70℃时，提取率达到最大值54%。原因与盐法提取蛋白质的温度影响相同，由此选择提取温度为60℃、70℃、80℃为碱法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

由图9可得，蛋白质提取率随着提取时间的增加而先上升后下降，当提取时间达到4 h时，提取率达到最大值52.13%。蚕蛾蛋白质中的谷蛋白不溶于水、中性盐，但溶于稀酸液、稀碱液。在溶解初期，蛋白质表面的酪蛋白最先溶解，随着提取时间的延长，蛋白质内层也逐渐溶解，但水分也会挥发，因此过长时间提取率下降。由此选择提取时间为3.5 h、4.0 h、4.5 h为碱法提雄蚕蛾蛋白质正交试验的因素。

2.3 盐法正交试验优化的结果

将设置的水平与因素带入运算，盐法提雄蚕蛾蛋白质的正交试验结果如表4所示。由表4直观可得，当提取率为最大值43.65%时，最佳因素组合为A1B2C2D2，由R值判断，影响因素的主次为B＞D＞C＞A。进一步以各因素的K1、K2、K3计算得到其偏差平均值，绘制效应曲线如图10所示，按照趋势，最大的组合即为最佳因素组合应为A1B2C2D3，从各因素的斜率来看，降幅最大的为最主要影响因素，可得影响因素的主次为B＞D＞C＞A。重复3次试验，组合为A1B2C2D3的蛋白质提取率均值为44.36%，提取蛋白质含量均值为34.5%。综合可得，当盐法提取雄蚕蛾蛋白质在盐浓度1.5%，料液比（g/mL）为1∶10，提取温度为40℃，提取时间为4.5 h时可获得最大提取率，为最优盐法提雄蚕蛾蛋白质的实验方法，提取因素的主次排列依次为料液比（g/mL）＞提取时间＞提取温度＞盐浓度。

表4 盐法提雄蚕蛾蛋白质正交试验结果

2.4 碱法提雄蚕蛾蛋白质正交试验优化的结果

将设置的水平与因素带入运算，碱法提雄蚕蛾蛋白质的正交试验结果如表5所示。由表5直观可得，当提取率为最大值57.81%时，最佳因素组合为A3B1C3D2，由R值判断，影响因素的主次为D＞C＞A＞B。进一步以各因素的K1、K2、K3计算得到其偏差平均值，绘制效应曲线如图11所示，按照趋势，最大的组合即为最佳因素组合应为A2B2C3D3，从各因素的斜率来看，降幅最大的为最主要影响因素，可得影响因素的主次为D＞C＞A＞B。重复3次试验，组合为A2B2C3D3的蛋白质提取率均值为57.62%，蛋白质含量均值为47.69%。综合可得，当碱法提取雄蚕蛾蛋白质在碱浓度2%，料液比（g/mL）为1∶8，提取温度为80℃，提取时间为4.5 h时可获得最大提取率，为最优碱法提雄蚕蛾蛋白质的实验方法，提取因素的主次排列依次为提取时间＞提取温度＞碱浓度＞料液比（g/mL）。

表5 碱法提雄蚕蛾蛋白质正交试验结果

2.5 复合盐法-碱法提取雄蚕蛾蛋白质

通过以上实验所得盐法和碱法的最优提取条件，先用盐法提取蛋白质，即盐浓度1.5%，料液比（g/mL）为1∶10，提取温度为40℃，提取时间为4.5 h之后在所得液的基础上用碱法再提取蛋白质，即碱浓度2%，料液比（g/mL）为1∶8，提取温度为80℃，提取时间为4.5 h。之后经过离心分离除杂、沉淀析出目标蛋白、透析、烘干，经三次试验取均值，得到的提取率为54.68%，低于碱法又高于盐法；蛋白质含量49.12%，高于碱法和盐法。主要原因是在盐溶液的基础上加碱再中和，使得溶液中盐浓度的浓度增加，造成部分蛋白质析出而损失。但由于碱法要求的提取温度较高，容易发生“胱赖反应”，蛋白质会脱氨基、脱羧、肽键断裂，产生有毒物质，只能得到羟基氨基酸、消旋化的氨基酸，含硫氨基酸少。而盐法相对保护蛋白质活性，蛋白质可食用价值更高[15]。复合法在盐法基础上进行碱法，比较单纯碱法，碱浓度较低，固液比较稀，对蛋白质损害少，而且能够溶解谷蛋白，得到的蛋白质种类更全。

3 结果与讨论

本文致力得到可食用的高纯度雄蚕蛾粗蛋白，通过两种不同方法提取雄蚕蛾蛋白质，进行单因素试验，比较不同提取方法蛋白质提取率的差异，再用正交试验进一步选出最优提取条件，获得最佳复合盐法—碱法提取雄蚕蛾蛋白质的工艺。

由上述试验可得，盐法提取雄蚕蛾蛋白质，最优提取条件为盐浓度1.5%，料液比（g/mL）为1∶10，提取温度为40℃，提取时间为4.5 h，提取率为44.36%，蛋白质含量为34.5%，提取因素的影响主次排列依次为料液比（g/mL）＞提取时间＞提取温度＞盐浓度；碱法提取雄蚕蛾蛋白质，最优提取条件为碱浓度2%，料液比（g/mL）为1∶8，提取温度为80℃，提取时间为4.5 h，提取率为57.62%，蛋白质含量为47.69%，提取因素的影响主次排列依次为提取时间＞提取温度＞碱浓度＞料液比（g/mL），复合盐法—碱法提取雄蚕蛾蛋白质，提取率为54.68%，蛋白质含量49.12%。综上所述，盐法、碱法、复合盐法—碱法提取雄蚕蛾蛋白的提取率高低依次为碱法＞复合盐法—碱法＞盐法，蛋白质含量高低依次为复合盐法—碱法＞碱法＞盐法。碱法提取雄蚕蛾蛋白质的提取率虽然高，但由于长时间高温的碱液浸泡，提取蛋白色泽较黄，有不良风味，而复合法提取的蛋白质色泽较白，味道较小，更能保持蛋白质的功能与结构，适合食品加工应用。

相比孙雁等[16]用碱法提取缫丝蚕蛹蛋白，其提取率高达78.69%，可能原因一是样品为缫丝后的脱脂蚕蛹，二是蛋白质测定方法为凯氏定氮法，三是提取工艺不同。而张健等[17]用碱法提取柞蚕蛹蛋白质，用改良的Bradford法测定蛋白质浓度提取率达到52.73%；王林美等[18]用微量凯氏定氮法测定鲜雄蚕蛾蛋白质，蛋白质含量在14.65%；杜立群等[19]用生理盐水提取柞蚕蛹蛋白质，凯氏定氮法测定，粗蛋白得率为38.98%，可见不同样品前处理方法、不同蛋白质提取方法、不同蛋白质测定方法得到的蛋白质提取率不同。又由于蚕蛾蛋白质中的醇溶蛋白只溶于60%～95%的醇溶液、强碱和有机溶剂中，则本研究的提取方法可能损失这部分蛋白。造成实验数据误差的影响因素还可能和样品的破碎程度、中性盐沉淀的条件、油脂残留量、多糖量等有关。此外，本研究缺少雄蚕蛾烘干条件的选择、等电点的选择等预试验，在今后进一步优化工艺上有待突破。

昆虫蛋白质测定方法主要有凯氏定氮法、考马斯亮蓝法、双缩脲法、BCA法等，其中凯氏定氮法测定蛋白含量比较高，容易受非蛋白含氮物质干扰[20]，而考马斯亮蓝法中染料不与小分子量氨基酸结合，受去污剂、泡沫影响，干扰实验的准确性，BCA法受多糖、尿素、β-巯基乙醇等因素影响[21]，试验结果皆有误差。因此接下来可拓展本提取方法对不同蛋白质测定方法的适用性研究。