HBsAg新增N-糖基化突变的研究进展*

傅晓春，叶辉铭(厦门市妇幼保健院医学检验科，福建厦门 361003)

HBV作为一种含不完全闭合双链的DNA病毒，至今在全球仍约有2.4亿慢性感染者[1]。HBsAg作为HBV感染常见的筛查标志物，与HBV DNA定量检测的联合应用能更好地监测患者的HBV感染自然史，基线HBsAg水平可帮助改进免疫调节治疗和核苷类似物(nucleotide analogues, NAs)治疗的方案[2]。然而，近年较多报道HBsAg上存在一种新增N-糖基化(N-linked glycosylation)突变，可对其自身抗原性、病毒复制力、宿主免疫应答和HBV相关肝脏疾病进程产生影响[3-15]，可能影响疫苗接种、HBV检测及临床治疗评估[5-8,10,12-15]。因此，本文对此作一综述，以指导乙肝疫苗的改良、HBsAg检测试剂的研发、降低HBV传播风险并优化临床治疗策略。

1 HBsAg的新增N-糖基化突变及其检测

N-糖基化是一种在内质网(endoplasmic reticulum，ER)和高尔基体(golgi apparatus，GA)中进行的新生肽链的翻译后修饰方式，其修饰位点须有一致的氨基酸序列N-X-S/T(N为天冬酰胺，X为脯氨酸以外的任意氨基酸，S为丝氨酸，T为苏氨酸)，因此可以依靠质谱分析和数据库检索手段实现大规模位点鉴定[16-18]。N-糖基化的蛋白质结构复杂，缺少特征的吸收光谱，通常情况下为电中性，并且虽然其是生物体内普遍发生的一种翻译后修饰，但丰度通常较低，需要经过凝集素亲和法、酰肼化学法、亲水作用色谱法及硼亲和法等进行富集[19]，并通过分子荧光标记、放射性标记法、抗体标记、化学衍生和凝集素标记等进行衍生化，使之具有荧光特性、紫外吸收或其他一些可测定的物理化学性质，才能实现深度覆盖分析[20]。

HBV进入肝细胞须借用细胞器完成自身蛋白质的合成与修饰，其部分外膜蛋白需经过N-糖基化修饰，每增加1个糖基化，蛋白质相对分子质量则增大约3 000，其糖基可被糖苷内切酶 PNGase F或Endo H移除[16,18]。 HBV主蛋白(S-HBsAg)有糖化型(GP27，位于主蛋白的sN146)和非糖化型(GP24)，中蛋白(M-HBsAg)有单糖化(GP33，位于主蛋白的sN146)和双糖化(GP36，位于前S2蛋白的N4和主蛋白的sN146)，大蛋白(L-HBsAg)有非糖化型(GP39)和糖化型(GP42，位于主蛋白的sN146)，糖化型/非糖化型数量比约1∶1[5]，以sN146对HBsAg分泌最为重要[4]。研究表明，N-糖基化在蛋白质折叠、运输、免疫应答、病毒感染及维持蛋白质稳定等过程中扮演着重要角色[11]。目前，对于HBsAg新增N-糖基化位点的发现主要通过测序分析进行预测，并构建融合蛋白表达相应突变蛋白，同时使用糖基化酶抑制剂(衣霉素)进行干扰试验，然后经PNGase F或Endo H移除N-糖基，再通过免疫印迹试验确认推测的位点是否产生新增N-糖基[7,12,14,16-17]。而当前商品化HBsAg定量检测试剂均未区分糖基化与非糖基化HBsAg，对新增N-糖基的HBsAg仍缺少特异的检测方法，因此，不同位点新增N-糖基的HBsAg在不同检测平台可存在较大检测差异[14]，仍需要继续研发新的检测方法。

既往对HBsAg新增N-糖基化的报道主要见于HBsAg与抗HBs双阳性的乙肝患者和部分隐匿性乙型肝炎(occult hepatitis B，OBI)患者。HBsAg上一些特定位点的替换突变或插入突变可形成N-X-S/T结构，产生新增N-糖基(主要位于主要亲水区)。目前报道的自然发生的替换突变位点有：sG112N、sT113N、sT116N、sT123N、sQ129N、sG130N、sT131N+sM133T[9,11-12,14-15,21-23](图1)，不同HBV基因型的突变位点存在差异。例如，B型HBV仅发现sT131N+sM133T，而其他位点在C型HBV均可见，以sT131N+sM133T最常见。插入突变见于s112-113、s113-114、s114-115、s115-116、s125-126、s135-136的氨基酸之间插入2～8个不等的氨基酸[9,13-14,21-22]，均位于主要亲水区(图1)。

2 HBsAg新增N-糖基化对HBV的影响

HBsAg作为宿主主要的免疫原，新增N-糖基化的出现可能导致其蛋白质构象的变化，改变其抗原性，造成HBV免疫逃逸及HBsAg检测失败。同时，由于HBV S区与P区基因的重叠，逆转录酶(reverse transcriptase,RT)蛋白的改变还可能发生NAs耐药。

既往临床研究均显示，血清HBsAg与抗HBs双阳性的乙肝患者相比于HBsAg单阳性者，血清HBV含有较高比例的HBsAg新增N-糖基化突变，差异有统计学意义[6，22-24]。在OBI与非OBI患者中也有相同的发现[14-15]。说明HBsAg的新增N-糖基化可能改变或降低了HBsAg的抗原性，造成HBsAg和抗HBs共存[25]，使得HBsAg检测假阴性而形成OBI[15]。

基础研究证实，不同位点的新增N-糖基化突变可不同程度降低HBsAg的抗原性[5,8,12,15,26]。刘妍等[14]通过构建HBsAg-myc-His融合蛋白分析在OBI患者中发现的sQ129N、s115-116插入INGTST、s126-127插入RPCMNCTI和sT116N+sT131N/sM133T突变，发现4种突变均产生新增N-糖基化，且激光共聚焦分析显示，4种突变株HBsAg/His标签的荧光强度比值相比野生型分别降低了76.3%、53.4%、67.1%和52.7%，用6种HBsAg临床试剂进行检测，结果显示后3种突变株对试剂的反应性均明显降低，其中4种试剂检测不出。而Yu等[6]通过PNGase F去除新增N-糖基化基团后，HBsAg与试剂的反应性提高2～4.88倍不等。因此，研究者认为新增N-糖基化阻碍了HBsAg的检测而不是抗原的产生[15]。值得注意的是，新增N-糖基化突变却能提高HBV的复制和分泌，使突变型HBV成为优势株[27]，因此造成患者高病毒载量而低HBsAg的假象[6,22,26-27]，可导致临床对患者病情的错误评估。然而，Kang等[12]和Li等[7]的研究认为部分突变(例如sQ129N或sT123N)明显损害HBV复制力和病毒分泌。研究结论的不同可能由于使用的复制性质粒的差异而导致，有待更多的研究数据进行确认。

3 HBsAg新增N-糖基化对宿主免疫的影响

HBsAg上非糖基化/糖基化sN146的共存提示其在HBV的感染和宿主免疫过程中可能存在双重功能[5]。Julithe等[5]研究显示，非糖基化的sN146对HBV感染肝细胞必不可少，而糖基化除了对HBV病毒分泌至关重要，还可保护“a”决定簇免受中和抗体的作用。在HBsAg高糖基化时(s115、s129和s136同时发生糖基化)，突变型病毒颗粒进入肝细胞的量相比野生型显著减弱，并获得对中和抗体的抗性。新增N-糖基化可能通过遮蔽“a”决定簇，逃避抗HBs的识别[6,12]。刘浩等[3]研究表明，去除M-HBsAg N4糖基化位点可导致细胞免疫和体液免疫反应下降，但若通过定点诱变在M-HBsAg第5或7位氨基酸新增N-糖基，能修补或替代N4糖基位点的功能。Kang等[12]构建sT123N突变型HBV复制性质粒，用电穿孔法进行小鼠体内DNA免疫，成功诱导了与野生型HBV相当的抗HBs反应。然而Li等[7]用小鼠尾静脉高压水注射sT123N突变型HBV复制性质粒进行动物实验，却发现sT123N减低了HBsAg的表达，可能因此损伤病毒颗粒的分泌，导致HBcAg在细胞内滞留，但小鼠对HBsAg和HBcAg的抗体反应明显增强，加速了HBsAg的清除。2个研究采用的动物实验方法的不同可能是导致结果差异的原因，仍需要进一步实验验证。

高甘露糖型HBV可被树突状细胞(dendritic cell,DC)表面特异性细胞间黏附分子3结合非整合素(DC-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing nonintegrin，DC-SIGN)识别，促进DCs的成熟和活化[28]。邹小静等[29]和Wang等[30]研究发现，用基夫碱(α-甘露糖苷酶抑制剂)处理人肝癌细胞Hep G2.2.15细胞后收获高甘露糖型HBV颗粒，发现相比野生型HBV颗粒，高甘露糖型HBV颗粒经DC-SIGN识别后对DCs成熟和活化的促进作用更强，而DC-SIGN基因沉默可消除2型HBV对DCs影响的差异。因此认为，天然的HBV可能利用α-甘露糖苷酶参与的去甘露聚糖修饰来逃避DC-SIGN的识别，从而诱导DCs功能的缺陷，导致HBV的慢性感染。但目前未有研究者对新增N-糖基形成的高糖基化HBV对DC-SIGN的影响进行研究，我们推测该类型突变对宿主的免疫反应可能具有相似的影响。Hyakumura等[17]与Joe等[16]研究表明，通过糖工程生产的新增N-糖基的高糖基化HBsAg病毒样颗粒，可能由于糖丰度的提高，刺激了抗原提呈细胞的糖蛋白受体，大大地增强了自身免疫原性，有效地刺激机体产生更持久的免疫反应。该研究成果为开发更安全有效的HBV疫苗提供了新思路。

4 HBsAg新增N-糖基化对肝脏相关疾病发生发展的影响

多项针对HBsAg与抗HBs双阳性或OBI患者的研究表明，HBsAg新增N-糖基化与肝脏疾病进程相关。陈杰等[13]则发现慢加急性肝衰竭(acute-on-chronic liver failure,ACLF)患者相比慢性乙肝患者，HBV包膜蛋白正常糖基化位点变异导致糖基化缺失的比例更高，认为正常糖基化位点的N-糖基化水平降低可能与ACLF的发生相关。Chen等[26]在OBI患者中发现13个未被发现的突变模式，分析表明，随着病程的延长，preS2起始密码子M→I+sT131N/M133TT突变的比例增加。乔艳等[9-10]与卢姗姗等[22]研究显示，HBsAg与抗HBs双阳性的乙肝患者相比于HBsAg单阳性的乙肝患者有更高的新增N-糖基化发生率，且肝癌发生率更高，认为HBsAg与抗HBs双阳性叠加主要亲水区新增N-糖基化可能是HBV感染者发生肝细胞癌(hepatocelluar carcinoma,HCC)的风险预测指标，但仍需要更多的基础研究来澄清这些病毒突变是驱动因素还是仅仅是一种指示标志[10]。例如，Liu等[4]的研究则有力地证明了N-糖基化修饰L-HBsAg可以调节L-HBsAg的分泌，影响内质网应激、细胞周期和增殖，其中N320K(即主蛋白sN146K)导致的糖基化缺失可阻断L-HBsAg的分泌，导致G1期细胞增多，S期细胞抑制，抑制有丝分裂的进入，这可能是HBV诱发肝癌的机制之一。对于含该突变的乙肝患者更容易发生HCC的分子免疫学机制仍需要进行探索。

5 总结

对于研究者来说，对HBsAg新增N-糖基化的研究需要规范、统一的研究方法进行实验，以获得一致的研究结果。通过构建融合蛋白表达载体瞬时转染肝细胞系，表达出HBsAg的融合蛋白进行蛋白质分析[6]，或者经构建HBV复制性质粒体外转染肝细胞[22]的细胞模型建立，均无法模拟宿主体内免疫网络以及组织器官结构的真实内环境，不利于观察HBV的体内复制过程和免疫动态变化。并且，对于该突变导致的RT蛋白改变对NAs治疗的影响尚缺乏关注，感染此类突变HBV更容易发生HCC的具体机制的研究仍不够深入。因此，需要在分子、细胞和动物水平上进一步系统性地分析该类型突变影响乙肝患者NAs治疗及疾病进程的机制。

对于临床工作者来说，应注意此类突变导致的HBsAg抗原性变化，防止由于此类患者 HBsAg定量结果偏低甚至假阴性[14]，导致低估患者病情甚至误诊。还应关注此类突变的HBV导致的OBI对临床用血安全的威胁，以及由此出现免疫逃逸而导致HBV传播[15]。其有效的解决办法是开发针对此类突变的HBsAg检测试剂防止检测结果的偏差，而糖工程产生的高糖基化HBV疫苗为未来的HBV防治提供了新道路，值得尝试[16]。同时，由于该突变对HBV复制力的影响，可能需要根据患者治疗情况作出相应的NAs用药调整。此外，对于感染此类突变HBV的患者，应注意加强随访，以预防不良肝脏相关疾病的发生[10,13,22]。