淋病奈瑟菌实验室检测技术进展*

郑晓丽，陈绍椿，尹跃平(中国医学科学院皮肤病医院，中国疾病预防控制中心性病控制中心，南京 210042)

淋病是由淋病奈瑟菌(Neisseriagonorrhoeae,NG)感染而引起的一种常见的性传播疾病。NG属于奈瑟菌属，人类是其唯一天然宿主，可引起泌尿生殖道感染(如尿道炎、宫颈炎等)和泌尿生殖道外感染(如直肠炎、咽炎、眼炎等)。淋病的实验室检测主要是病原学检测，常用的传统方法有显微镜检查法和培养法，近年来随着分子生物学诊断技术的发展，核酸检测逐渐成为实验室检测指南推荐的方法之一。本文对传统方法、分子生物学及其他方法的检测特点进行综述，为临床NG检测方法的选择提供参考。

1 传统方法

1.1显微镜检查法 显微镜检查法是临床上NG检测的传统方法之一。在有尿道炎症状的男性患者中，革兰染色直接镜检敏感性可达95%，特异性可达97%[1]，显微镜下发现多形核白细胞内革兰阴性双球菌时，具有诊断价值[2]。在男性无症状尿道感染患者和女性患者中，直接镜检敏感性及特异性均较低。咽部存在与NG同奈瑟菌属的其他共生菌，形态与NG相同，镜检的特异性较低。因此，对于泌尿生殖道外感染的检测，应采用细菌培养等方法。

1.2培养法 培养法有较高的敏感性和特异性，是NG实验室检测诊断“金标准”[3]。对女性患者、无症状感染者和判愈试验都有较高敏感性。此外，细菌培养还可进一步用于检测抗菌药物的敏感性。

影响细菌培养敏感性的因素主要包括取材部位、标本运输、判断标准选择及患者人群等。对于泌尿生殖道标本，即时进行细菌培养有较好的敏感性。Walsh等[4]发现对泌尿生殖道标本，培养敏感性为100%；Goh等[5]的回顾性研究发现，在女性宫颈NG感染中，培养阳性率为93.6%；在女性尿道NG感染中，培养阳性率为94.8%。对泌尿生殖道外标本，培养的敏感性较低。部分不具备培养能力的临床实验室可将标本转运至其他实验室进行检测，但长时间运输会影响NG活性使培养阳性率下降[6]。Harryman等[7]报道了运输标本培养的敏感性，以核酸检测阳性和培养阳性为真阳性，有症状男性尿道标本培养的敏感性为79%，无症状男性为29%；有症状男性直肠部位标本培养的敏感性为55%，无症状男性44%；有症状女性生殖道部位标本培养敏感性为 53%，无症状女性47%。NG是苛养菌，对干燥、寒冷、热和消毒剂均敏感，因此标本转运时需注意保温保湿，立即送培养，或在转运培养基接种后送培养。

培养后的菌株通常采用生化反应进一步鉴定，NG氧化酶试验阳性，能分解葡萄糖，不分解麦芽糖、蔗糖、乳糖，可以此和其他奈瑟菌进行鉴别，或是用全自动细菌鉴定仪进行进一步鉴定。

2 分子生物学方法

NG检测的分子生物学方法主要包括核酸检测和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)。

2.1核酸检测 核酸检测方法包括核酸杂交试验和核酸扩增试验(nucleic acid amplification tests, NAATs)两大类。核酸检测速度快、敏感性高，对标本保存和转运条件要求低，检测结果可不受NG存活状态的影响，且NAATs可以采用非侵入性取材标本(尿液或阴道拭子等)。

2.1.1核酸杂交试验 核酸杂交试验使用标记的DNA探针来识别微生物的特定核酸序列，不扩增目的基因，需使用直接从尿道或宫颈内采集的拭子[8]。核酸杂交试验对标本的储存和转运要求没有细菌培养严格，标本可在室温下7 d内保持稳定[9]。但其敏感性低，随着NAATs方法的出现，核酸杂交试验在临床已经很少应用。

2.1.2NAATs NAATs方法通过扩增NG特异性基因片段检测NG，主要采用实时荧光PCR进行检测，亦有采用转录介导扩增技术(transcription mediated amplification，TMA)、链置换扩增(strand displacement amplification，SDA)等检测。目前，美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于NG检测的使用较多的试剂盒有基于实时荧光PCR的Cobas 4800 CT/NG(Roche公司)、Real Time CT/NG(Abbott公司)、CT/NG Xpert(Cepheid公司)、MAX GC、MAX CT/GC、MAX CT/GC/TV(BD公司)，基于TMA的Aptima Combo 2(Hologic公司)，基于SDA的Probetec ET(BD公司)和Probetec GC Qx(BD公司)，以及使用普通PCR的Amplicor(Roche公司)。binx io CT/NG Assay(binx health公司)是首个经FDA批准用于床旁检测的试剂盒，可在30 min获得结果[1]。Cepheid Xpert CT/NG和Roche Cobas 4800 CT/NG已在国内注册。国内亦有大量注册的用于NG核酸检测的试剂盒，其主要采用PCR荧光探针法、荧光PCR和RNA恒温扩增法。单次NAATs的敏感性随采用的扩增技术(PCR、SDA、TMA)、标本来源和类型的不同而异。

NAATs敏感性高，可检测多种泌尿生殖道标本，包括尿液标本(来自男性和女性)、阴道拭子和宫颈拭子，首选标本是男性晨尿和女性阴道拭子[10]。女性不管有无症状，NAATs对生殖道部位标本敏感性均很高[7]。Gaydos等[11]报道，对女性患者，NAATs检测阴道拭子与宫颈拭子敏感性均为100%，而检测尿液标本的敏感性(95.6%)略低于前两者。对男性患者尿道标本，不管患者有无症状，NAATs检测的敏感性均很高，有症状男性的NAATs检测敏感性达99%，无症状男性检测敏感性为94%[7]。有研究发现，NAATs在泌尿生殖道标本的阳性检出率高于培养法[12-13]。王勤婉等[13]检测1 491份泌尿生殖道标本，发现PCR荧光探针法(6.64%)的阳性检出率高于培养法(4.16%)，差异有统计学意义。

一些研究已证实，NAATs检测泌尿生殖道外部位(如口咽部和直肠)标本的敏感性显著高于培养[4,7]。NAATs检测泌尿生殖道外部位淋病的问题主要是特异性，因为泌尿生殖道外部位有非致病性奈瑟菌存在，可能存在交叉反应。Tabrizi等[14]评估6种(Gen-Probe Aptima Combo 2 和 Aptima GC，Roche Cobas Amplicor CT/NG和Cobas 4800 CT/NG，BD ProbeTec GC Qx，Abbott Real Time CT/NG)NAATs对450株临床株(包括216株NG、218株非NG性奈瑟菌和16株密切相关的非奈瑟菌)的特异性，发现除Cobas Amplicor CT/NG有4株(1.9%)NG未鉴定出，其余均准确鉴定了216株NG；在234株非NG分离株的鉴定中，由于交叉反应，Cobas Amplicor和ProbeTec检测假阳性率最高，余4种假阳性率较低，在重新培养菌落再次测定后，Aptima Combo 2、Abbott Real Time和Cobas 4800的检测结果中无假阳性结果存在。随后，Golparian等[15]对Aptima Combo 2和Aptima GC检测展开研究，在检测的205株NG和298株非NG菌株中，由于污染亦有假阳性结果的存在，在排除污染重新培养，稀释后再测定，无假阳性结果，敏感性和特异性均为100%，表明NAATs检测的准确性的提高需要严格的质量控制(阳性和阴性质控以及环境质控)、排除污染和设置合适的参数。目前，FDA已批准Aptima Combo 2(Hologic公司)和CT/NG Xpert(Cepheid公司)用于检测咽部和直肠部位标本。WHO和美国疾病预防控制中心(CDC)推荐在诊断直肠和咽部NG感染时优先选择NAATs[10，16]。截至2020年7月，我国国家药品监督管理局网站上注册的NAATs检测方法仅用于泌尿生殖道NG感染检测。

核酸检测的另一优势是患者自采标本与临床医生采集标本也有较好的一致性。自采和医生采集的宫颈阴道拭子敏感性相当(Cobas 6800/8800)[17]，自采和医生采集的直肠拭子检测NG的敏感性分别为77%和68%(ProbeTec)、84%和78%(Aptima Combo 2)[18]，自采和医生采集的咽部标本之间的一致性为96.6%(Aptima Combo 2)[19]。

NAATs能够快速获得结果，敏感性高，对标本的留取要求相对低，可非侵入性取材，但是NAATs试剂和仪器设备相对昂贵，对实验室环境要求高，必须严格把控操作过程，且存在一定的假阳性率。此外，NAATs无法进行抗菌药物敏感性试验，在临床应用时应根据实际需要加以选择。

2.2MALDI-TOF MS MALDI-TOF MS是近年来发展起来的一种新型软电离质谱，是一种快速而强大的检测工具，广泛应用于病原微生物的鉴定。

Buchanan等[20]分别用MALDI-TOF MS和API NH生化方法对1 090株常规临床标本分离株进行NG鉴定，其中1 082株被API NH鉴定为NG；MALDI-TOF MS首次分析后成功鉴定984份(91%)，二次分析后1 081份(99.9%)被成功鉴定，阳性预测值为99.3%。首次鉴定失败的分离株中，76%因为无法产生可识别的蛋白质指纹图谱，24%因为初始鉴定为非NG。Morel等[21]评估了Bruker Biotyper和Andromas对88株NG、18株脑膜炎奈瑟菌和29株共生奈瑟菌的鉴定能力，这2个系统均正确鉴定了88株NG。但是，Pandey等[22]报道咽部标本培养后使用MALDI-TOF MS进行鉴定，使用Bruker公司RUO MALDI Biotyper、MALDI Biotyper CA和CDC MicrobeNet均首先鉴定为NG，而16S rRNA测序示N.meningitidis/N.cinerea。因此，在使用MALDI-TOF MS进行鉴定时应严格按照流程操作，在解读存在奈瑟菌属共生菌部位的结果时应谨慎，必要时联合其他检测方法进一步确证。

MALDI-TOF MS检测NG单个反应成本较低、操作简单、检测迅速，但需要对培养后的菌落进行鉴定，检测的准确性依赖于数据库中菌种的信息量和可靠性，需要进一步完善其数据库并临床评估其准确性。

3 其他检测方法

目前已有一些床旁检测方法用于淋病的快速诊断，如抗原检测。目前国内已批准的NG抗原检测商品化试剂盒仅用于女性宫颈分泌物、男性尿道分泌物标本中的NG抗原的筛查，但NG表面抗原变异大，国外报道的数据显示其敏感性和特异性较低[23]。此外，还有报道采用干化学酶法进行NG的检测[24]，但是国内外目前对此方法评价报道少。以上床旁检测方法在临床中的检测价值还需进一步评价。

4 小结

对不同人群、不同部位NG感染应选择相应敏感性和特异性均较高的检测方法(见图1)。对有尿道炎症状男性患者推荐首选显微镜检查法。细菌培养对即时采样检测标本的敏感性和特异性相对较高，仍是目前所推荐的“金标准”。NAATs具有高敏感性、高特异性、检测时间短等特点，且可非侵入性取材(如尿液标本)，标本运输方便，最新指南已列为淋病的常规检测手段之一。但是生殖道以外标本NAATs与其他共生奈瑟菌可能存在交叉反应，因此应谨慎解读存在共生奈瑟菌部位的NAATs阳性结果，必要时采用另一种方法确证。MALDI-TOF MS检测NG每个反应成本较低、操作简单、检测迅速，但其需要对培养后的菌落进行鉴定，且方法的准确性依赖于数据库的完善和临床评估验证。NG抗原变异大，目前的抗原检测方法需进一步大样本的临床评估。