马脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性试验

罗惠娜 ， 雷 彬 ， 王丙云 ， 王彩莹 ， 黄国健 ， 陈胜锋 ，陈志胜 ， 罗冬章 ， 詹小舒 ， 刘璨颖 ， 白银山

(1. 佛山科学技术学院生命科学与工程学院 ， 广东 佛山 528231 ； 2.广东省黄村体育训练中心 ， 广东 广州 510663)

干细胞(Stem cells, SCs)是一类具有自我更新能力和多向分化潜能的原始未分化细胞。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)作为干细胞家族中重要成员，也具有多向分化潜能，可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞等其他细胞，是再生疗法的成体干细胞中非常有前途的种子细胞[1-2]。在治疗运动系统及退行性疾病方面发挥着巨大的潜能[3]。在马兽医学中，MSCs适用于治疗马肌腱韧带拉伤和关节炎等损伤[4-8]。

肌腱和韧带拉伤、骨关节炎是人类和赛马临床常见的运动性疾病。迄今为止尚未发现理想的治疗方法。在过去的十几年中，潜在的再生疗法，特别是干细胞疗法引起了人们极大的兴趣。脂肪间充质干细胞(Adipose derived mesenchymal stem cells, AD-MSCs)是指来源于脂肪组织的MSCs。相比于骨髓来源的MSCs，具有来源丰富、操作简便、容易获得、体外增殖能力强等特征[9]，是治疗运动系统及退行性疾病的理想种子细胞。但目前缺乏标准化的分离、培养和鉴定马AD-MSCs的方法。现阶段，建立马AD-MSCs培养体系，将会对运动赛马等动物及人类干细胞的临床转化应用奠定基础。本试验主要研究了马AD-MSCs的分离方法、培养体系和生物学特性，为下一步疾病的治疗提供理想的种子细胞。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 由广州奥体马术场提供的中年纯血骟马。

1.1.2 主要试剂与设备 DMEM基础培养基(Hyclone公司)；胎牛血清FBS (BI公司)；0.25%胰蛋白酶(Hyclone公司)；0.1% Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；干细胞成脂诱导分化完全培养基(Cyagen公司)；干细胞成骨诱导分化完全培养基(Cyagen公司)；RNA提取试剂盒(TaKaRa公司)；反转录试剂盒(TaKaRa公司)；CD90-PE、CD45-FITC购自Abcam；CD105-FITC购自Invitrogen；CD44-FITC购自R&D。

超净工作台(苏州苏净公司)；荧光显微镜(Olympus公司)；超速低温离心机(Beckman公司)；PCR仪(Thermofisher公司)；流式细胞仪(BD公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 脂肪采集 对试验马匹进行镇静处理，颈部采集脂肪组织后进行常规外科缝合。将采集的脂肪组织放入含10%双抗的PBS缓冲液中，低温送回实验室进行下一步试验。

1.2.2 原代马AD-MSCs的分离、培养 PBS缓冲溶液清洗脂肪组织表面的血细胞2～3次，转移至培养皿中；用无菌器械将组织块剪碎至1 mm3，0.1%Ⅰ型胶原酶消化2 h至无明显大颗粒，100目细胞筛过滤，将滤液转移至15 mL离心管，1 000 r/min离心5 min，弃去上清；然后用含10%FBS的DMEM完全培养基重悬沉淀，调整细胞密度至1×106个细胞/mL，转移至60 mm培养皿置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后首次半量更换培养基除去大部分血细胞，以后每隔3 d更换1次培养基。倒置显微镜下观察细胞形态和生长情况，此时细胞即为P0代马AD-MSCs。

1.2.3 细胞传代培养及生长特性观察 待细胞长至80%～90%汇合时，弃去上清液，用PBS清洗细胞1～2次。0.25%胰蛋白酶消化，用含10%FBS的培养基终止消化。离心、弃上清、进行传代扩增培养。显微镜下观察细胞生长状态及活性，并拍照记录。

1.2.4 细胞生长曲线制作及群体倍增时间的测定 绘制细胞生长曲线：依次取P2、P5、P8代马AD-MSCs，调整细胞密度至5×104个细胞/mL，接种于24孔板中， 置于37 ℃、含5%CO2的培养箱中进行培养。随后每天随机抽取5个孔消化，按细胞、台盼蓝体积分数比1∶1混匀， 采用Counstar细胞计数仪计数。每孔计数3次取平均值，持续8 d。绘制P3、P6、P9代细胞的生长曲线。横坐标代表培养天数(d)，纵坐标代表细胞数。

细胞群体倍增时间的计算：根据生长曲线的对数增殖期计算群体倍增时间。Patterson公式为DT=t×[lg2/(lgNt-lgNo)])，t为培养时间，No为首次记下的细胞数，Nt为t时间后的细胞数。

1.2.5 马AD-MSCs的生物学特性研究

(1)细胞形态学观察 倒置显微镜下观察原代及传代培养细胞的形态。

(2)马AD-MSCs表面标志物测定 消化P3代马AD-MSCs，调整细胞密度为1×106个细胞/mL。转移至1.5 mL离心管中，PBS清洗后离心，弃上清。分别加入一抗稀释液，标记的抗体有：CD105-FITC、CD45-FITC、CD90-PE、CD44-FITC。避光孵育30 min后离心弃去上清，加100 μL PBS重悬，流式细胞仪分析马AD-MSCs表面标志物。

(3)总RNA提取, cDNA合成和PCR基因检测 引物设计如表1，检测CD90、CD44、CD73和CD105等间充质干细胞表面标志物的相关基因。取P5代传代细胞，TaKaRa试剂盒提取总RNA, RNA浓度由分光光度计A260 nm测定。反转录成cDNA，-20 ℃保存备用。并将cDNA全组基因作为模板进行PCR体系扩增，电泳检测扩增产物。

表1 MSCs相关基因的引物序列

(4)马AD-MSCs的成骨诱导分化试验 取生长状态良好的P3代细胞，调整细胞密度为1×105个细胞/mL，接种至24孔板。试验分为对照组和试验组，每组3个重复。培养24 h后弃去原培液，PBS清洗2遍，试验组加入成骨诱导分化完全培养基，对照组则加入含10%FBS的DMEM完全培养基。3 d换1次液，直至试验组出现钙结节。然后用10%多聚甲醛固定30 min，经碱性磷酸酶染色10 min，PBS清洗后显微镜下观察并拍照记录。

(5)马AD-MSCs的成脂诱导分化试验 取生长状态良好的 P3代脂肪细胞，调整细胞密度为 1×105个细胞/mL，接种 24孔培养板上。试验分为对照组和试验组，每组3个重复。试验组按照说明书交替加入成脂诱导分化A液和B液，对照组则加入含10%FBS的DMEM完全培养基。培养3～5个循环后，10%多聚甲醛固定30 min，油红O染色10 min，PBS清洗后显微镜拍照记录。

2 结果

2.1 马AD-MSCs形态学观察 采用Ⅰ型胶原酶消化法得到原代培养的细胞呈圆形，胞体透亮。此时细胞杂乱，大量红细胞覆盖在表面，通过半数更换培养基除去大多数杂细胞。培养至72 h细胞开始贴壁，此时细胞形态多样，见图1A；培养至5 d时，细胞大量贴壁，细胞呈长梭形，胞质较大，折光性强，见图1C；培养至7 d，细胞达70%～80%汇合即可传代，传代细胞出现均匀分布的纺锤形，呈典型的漩涡状，见图1E；细胞传代至P9代仍能保持稳定增长，保持细胞形态不变，见图1F。

2.2 马AD-MSCs生长曲线及群体倍增时间的测定 如图2所示，P3、P6、P9代马AD-MSCs的生长曲线均呈典型的S型，第3天进入对数生长期，P3、P6代细胞第6天进入平台期，P9代细胞第8天进入平台期。P9代增值能力开始下降。绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律。图3所示为细胞群体倍增时间图。随着细胞代数的增加，群体倍增时间也递增。

图2 马AD-MSCs生长曲线

图3 群体倍增时间

2.3 马AD-MSCs表面标志物检测 P3代马AD-MSCs高表达间充质干细胞表面标志物CD105、CD44和CD90，不表达造血系细胞表面标志物CD45，见中插彩版图4。

2.4 马AD-MSCs表面标志物基因检测 MSCs相关基因PCR鉴定结果如图5所示，细胞高表达CD105、CD90、CD73和CD44基因。该结果符合间充质干细胞特性。

图5 PCR结果

2.5 AD-MSCs成骨诱导分化试验 取生长状态良好的P3代细胞进行成骨诱导分化鉴定，对照组细胞形态未发生明显变化，10 d后铺满整个培养皿，未出现钙结节。试验组加入成骨诱导培养液7 d后，细胞形态发生明显变化，呈现鳞片状、细胞堆积连接成片；诱导培养10 d出现钙结节，运用茜素红进行矿化结节染色。显微镜下观察试验组可见细胞融合重叠生长，整个视野形成大面积明显的红色致密结节。表明细胞形成矿化结节，对照组茜素红染色呈阴性，见中插彩版图6。

2.6 AD-MSCs成脂诱导分化试验 取生长状态良好的P3代细胞进行成脂诱导分化，对照组细胞形态未发生明显变化，试验组细胞加入诱导分化培养液后14 d，大部分细胞呈卵圆形，胞质内出现许多大小不一的脂质颗粒出现；21 d后脂滴逐渐增多。油红O 染色结果显示，试验组脂质颗粒被染成红色。表明马AD-MSCs有脂向分化的能力，对照组油红O染色呈阴性，见中插彩版图7。

3 讨论

MSCs是一种起源于中胚层，具有自我更新能力及诱导分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞及其他胚层细胞潜能的成体干细胞。相比于其他组织来源的MSCs，ADMSCs具有来源丰富、易获得、增殖能力强的特点，并具有趋化归巢到损伤组织、旁分泌和免疫调节等功能，应而广泛应用于再生医学和组织工程领域中[10]。目前，国内未见到有关马的AD-MSCs的分离、培养、鉴定及其在治疗马运动系统、退行性疾病方面的应用的报道。因此，建立马的AD-MSCs的分离方法、培养体系具有重要意义，能为马属动物相关疾病的治疗提供同源性的治疗用干细胞，并对干细胞运用的安全性、有效性提供理论依据。

目前主要采用组织块培养法、胰酶胶原酶法进行AD-MSCs分离培养。本试验采用Ⅰ型胶原酶消化法从脂肪组织分离得到马的AD-MSCs。在显微镜下可见纺锤形，呈典型的旋涡状生长。经多次传代后，细胞形态均能保持一致。相比其他培养方法，Ⅰ型胶原酶消化法更加温和，操作更简便，分离得到的细胞活性更好，能够传代次数更多[11]。通过细胞计数法观察P3、P6、P9传代细胞生长曲线及群体倍增时间，绘制的生长曲线符合Logistic生长曲线规律。P3～P6代细胞增值能力基本相同，P9代增值能力略低于P3～P6代细胞。

本试验结合使用 RT-PCR 和流式细胞术检测MSCs标志物，P3代马AD-MSCs高表达细胞表面标记分子CD44、CD105、CD90，不表达造血干细胞表面标记CD45；PCR扩增得到相应MSCs特定基因片段，与Sherman等[12]的研究结果相一致。在特定诱导环境和条件下，马AD-MSCs可向脂肪、肌肉、向骨、软骨、神经、血管等多种方向分化[13-14]。本试验分别对马AD-MSCs进行了成骨和成脂诱导分化，检测了马AD-MSCs的多向分化能力。成骨诱导培养基主要成分为β-甘油磷酸、地塞米松和抗坏血酸，其中地塞米松和抗坏血酸可促进骨成熟和细胞外基质中胶原的合成；β-甘油磷酸钠可促进细胞内钙盐沉积和钙化形成。茜素红染液可将钙盐沉积染成深红色得以在显微镜下观察。成脂诱导分化液中主要诱导因子有胰岛素、IBMX、罗格列酮、地塞米松，能够很好的促进间充质干细胞向脂肪方向诱导分化。这些结果均符合国际MSCs标准定义：即贴壁性，表达CD44、CD90、CD105等表面分子，不表达造血细胞表面标志物；在特定条件下可诱导分化为骨细胞和脂肪细胞[15]。

综上所述，本试验建立的该原代分离培养及鉴定方法简便快捷，可得到大量的马AD-MSCs。结果可靠、重复性和可操作性强，为间充质干细胞的临床应用提供稳定的来源。