肝脏同步辐射相位衬度成像的实验研究

刘安娜 ，苏 雅，马紫瑶，彭屹峰，肖体乔，杜国浩，何 伟

（1.上海中医药大学附属普陀医院放射科，上海 200062；2.中国科学院上海应用物理研究所，上海 200129；3.中国科学院北京高能物理研究所同步辐射实验室，北京 100049）

X射线是一种光，当X射线穿过物质并与物质发生作用后，其折射率可写成n=1-δ-iβ［1］，其中β 为吸收项，δ 为相位项，理论上在医学诊断使用能段范围，相位项比吸收项大1 000多倍，因此在吸收衬度很难探测的情况下仍有可能观察到相位的衬度。传统X射线成像混有折射和散射信息，因而降低了成像分辨力和衬度，而相位衬度成像利用X射线透过样品后携带的相位信息对样品内部结构进行成像，克服了传统成像方法的不足。常见的相位衬度成像技术有：类同轴成像（1995年发现）、衍射增强成像（diffraction enhanced imaging，DEI，1995年发现）、干涉法成像（1971年发现）及光栅成像技术4种（2002年发现）［2-4］。同步辐射是速度接近光速的带电粒子在作曲线运动时沿轨道切线方向发出的电磁辐射。由于同步辐射光的相干特性，其适于在相干衬度成像中应用。目前国际上大多数的同步辐射装置都有光束线能够开展相位衬度成像研究。本实验应用同步辐射光源对大鼠肝脏行相位衬度成像实验，以分辨率和衬度作为主要评估标准，对4种不同相位衬度成像方法进行比较，探讨相位衬度成像技术在肝脏组织上的成像价值及临床应用前景。

1 材料与方法

1.1 材料 选择4只8个月大小的SD大鼠，处死后取出肝脏，经35%～40%甲醛水溶液固定24 h后，取出干燥后置于样品架上，固定前同时行病理学常规HE染色。动物来源于上海中医药大学附属普陀医院，动物使用许可证号SYXK（沪2013-0055）。动物实验得到上海中医药大学动物伦理委员会的批准。

1.2 成像方法 4种成像方法成像光路设计不同。类同轴成像光路通过X射线经样品后直接成像。衍射增强成像则是在样品后方添加一块分析晶体，获得摇摆曲线（衍射强度随角度的变化曲线）后，选择在峰位和侧位不同位置，曝光时间5～10 s（以总曝光量达到饱和曝光量的75%为宜，与扫描位置、光束能量的实际值有关）。干涉法成像是在样品后方放置3块平行的由一整块硅单晶分割成的晶体。光栅成像是在样品后方与探测器之间放置一块自成像光栅和分析光栅。X射线能量范围主要分布在3～22 keV，实验采用12 keV。

探测器使用X射线CCD（charge couple device，电荷耦合器件）成像系统采集图像。

1.3 图像评价 所获得的图像一方面与病理切片进行对照；另一方面通过实物显微放大的方法测定其分辨率，即最细血管直径的平均值。使用NIH Image J program（version 1.37；National Institutes of Health，USA），血管显示级数判断：将主干血管作为初级，出现一次分支后升级成为2级，依次类推。

2 结果

4种相位衬度成像均可显示肝脏的8级分支血管，血管直径从主干到外周分支逐渐变细（图1），经显微放大法测量最细血管直径约30 μm。每种技术获得的图像具有不同特征：类同轴成像（图1a），利用同步光源的相干性和高亮度等特性直接成像，其图像分辨率较高但平面感偏强；光栅成像（图1b）利用2块光栅形成的角分辨能力来读取样品的折射角信号，造成竖直血管两侧的明暗变化，使血管凹陷下去，形成强烈的印痕效果；衍射增强成像（图1c），通过折射衬度成像，可观察到血管周围很强的边缘增强效应，由于增强的衬度使得图像有凸凹立体感、浮雕感；干涉法成像（图1d）通过干涉条纹把相位信号转变成可探测的强度信号，导致血管结构与周围肝脏组织之间的灰白差异。

通过肝脏的类同轴成像效果（图2a）与病理结果（图2b）及组织学示意图（图2c）对照，证实与组织切片具有较好的匹配性：血管、胆管明显显示，肝小叶结构（包括小叶间结构及窦状间隙血管）清晰显示；肝细胞在围绕窦状间隙中呈板状排列。

图1 分别为大鼠肝脏的类同轴相衬像（图1a）、光栅微分像（图1b）、衍射增强折射像（图1c）和干涉条纹像（图1d），均可清晰显示肝脏内血管结构主干及直至肝脏边缘的分支图2 类同轴成像（图2a）显示肝脏组织与病理示意图（HE 4×10，图2b，）及解剖线状示意图（图2c）对照，肝小叶结构中的中央静脉及周围呈放射状分布的肝窦结构均清晰显示且具有较好的匹配性

3 讨论

从微观上讲，常规的X线成像仅利用光波在穿透物质时其振幅的改变，而相位衬度成像则是基于光波的相位变化，当光波穿透物质时，其相位随密度变化的衬度比相应的吸收变化的衬度高得多。因此，利用相位衬度信息有可能获得更清晰的成像效果。

类同轴成像方法主要原理是：在类同轴成像中，均匀的相干光波通过界面非均匀的物体，光的强度不发生变化而波前将发生畸变，继续传播到一定距离，和未发生畸变的波面重叠而发生干涉，X射线通过物体后，传播一定的距离即能将相位信息转化为强度变化，即菲涅耳衍射成像——相位二阶导数衬度成像，因此可见相位变化。类同轴方法具有大视野、高通量和实时成像的优势［5-7］，获得的图像和目前的临床的X线图像相似，因此容易解释［8］。衍射增强成像原理［9］：X射线与物质作用后，会发生吸收、折射和散射，其中折射和散射光的出射方向会偏离入射方向，而衍射增强成像最重要的是使用分析晶体将透射、折射和散射光对成像的作用分离，并将小角散射滤除，因此可大大提高成像的衬度和空间分辨力。干涉法成像由MOMOSE等［10-12］首先引入成像研究。干涉法是发现软组织内微小折射指数差异的最敏感的方法，但需精密复杂的干涉仪，且对干涉仪晶体准直度和机械稳定性要求高，加上受晶体尺寸和成像视野的限制，其应用亦受到限制［11，13］。光栅成像是利用光栅干涉仪将由样品引起的入射波前畸变信息转化为莫尔条纹的畸变，应用相阶方法采集数据再通过探测器（CCD）记录莫尔条纹［14］，对不同图像的同一像素点进行正弦曲线拟合，从而获得成像结果。其可得到更好的成像结果和更加丰富的样品信息，将会在生物医学领域发挥更好的作用。上述各种方法对于微小血管的显示均较清晰，分辨率可达微米量级。

与常规医用检查设备相比，同步辐射在肝脏组织成像中的主要优势为可在宽能范围内发出极高通量的单色准直X射线束。理论依据包括：同步辐射X线的高亮度特性。同步辐射的相干性特性使其可行肝脏组织的相位衬度成像。同步辐射相位衬度成像技术空间分辨率可得到明显提高达到微米量级，能够显示包括胆管、中央静脉在内的肝小叶结构。

肝小叶是肝的基本结构单位，呈多角棱柱体，长约2 mm，宽约1 mm，成人肝脏有50万～100万个肝小叶。肝小叶中央有一条沿其长轴走行的中央静脉，肝索和肝血窦以中央静脉为中心向周围呈放射状排列。几乎所有的肝脏疾病都能引起肝脏微细结构的改变，因此小叶微细结构的变化对于病变的诊断和评价特别重要。肝细胞癌是典型的多血管恶性肿瘤，肿瘤细胞的无节制性生长和远处转移都是建立在肿瘤新生血管形成的基础上的。因此，早期显示微血管的改变，对其早期诊断和治疗均具有重要临床意义。李蓓蕾等［15］利用同步辐射衍射增强成像技术对离体人肝细胞癌新生血管进行研究，结果表明该技术能够获得较满意图像，可显示肿瘤呈膨胀性生长、边界清晰，肿瘤边缘或周围可见较粗大的血管受压呈弧形移位；瘤内微小血管较丰富，分布杂乱无章，形态无规则，测得的最细血管直径约25 μm；在摇摆曲线不同位置记录的肝细胞癌图像的差异显著。林慧敏等［16］通过光栅X线相衬成像法对动物样品进行成像，结果显示在无对比剂情况下，第3代同步辐射光栅X线相衬技术能对胃癌肺转移灶及血管结构清晰成像，显示血管直径达15～30 μm，接近低倍光学显微镜下的图像，说明光栅X线相位衬度成像对显示裸鼠胃癌肺转移灶中的新生血管具有较高应用价值。

本研究的不足：本研究未使用对比剂，无法根据增强扫描不同时相判断是肝脏动脉、静脉还是门静脉［17］。今后应根据肝动脉、静脉及门静脉血液内成分含量的差异导致的折射率或荧光效进行区分。尽管目前无法区分血管的类别，但也不能否认血管的显示对乳腺癌、肝癌、胃癌的成像研究结果均有帮助。李瑞敏等［18］在利用同步辐射类同轴相衬技术对人乳腺癌标本进行成像，观察乳腺癌肿瘤新生血管的形态和分布；在不应用对比剂的情况下成功获得微米量级的乳腺肿瘤新生血管，并能清晰显示最小直径约9 μm的肿瘤血管；本研究选取新鲜的乳腺癌标本，手术取出后立即放入35%～40%甲醛水溶液中固定，保证了肿瘤血管内的血液能及时固定而不被其他物质影响，从而真实反映肿瘤新生血管的状态，在无对比剂情况下即可实现肿瘤新生血管的成像，避免使用碘对比剂带来的不良反应，为不用对比剂行血管成像提供了一定思路。

综上所述，相位衬度成像具有较高的组织衬度及较好的图像分辨力，能够显示包括肝小叶在内的微小结构或多级血管分支结构，有助于观察肝脏肿瘤生长过程中新生血管的形态、分布，以及肝脏组织细胞微观层面的研究，有望在肝脏的生理、病理及病变机制的可视化研究上发挥重要作用。