不同产地浮小麦HPLC指纹图谱研究

袁为玲，惠 明，田 青，黄继红

河南工业大学 生物工程学院，河南 郑州 450001

禾本科植物小麦干瘪轻浮的颖果称为浮小麦(FructusTriticiLevis)。浮小麦性凉，味甘甜，作用于肾、脾、心，可止汗、除热、益气，对自汗、盗汗、骨蒸劳热等疾病有较好的疗效[1-2]。临床广泛用于更年期潮热、盗汗、自汗、儿童汗症等疾病的治疗[3-6]。浮小麦资源丰富，在我国华北、华东、华中、东北等地区均有产出，目前从中先后检测出亚油酸、5-二十一烷基间苯二酚、棉籽糖、葡萄糖、微量元素等多种化学成分，由于各产地地理位置、生态环境等条件不同，造成不同产地浮小麦化学成分含量具有差异性[7-11]。《中国药典》2015年版中收录浮小麦配伍药方的用量及使用方法，但未对浮小麦质量控制提出明确要求[12]。在质量评价过程中只采用单一或几个指标不足以表现浮小麦的整体特性，故作者选用不同产地浮小麦，运用相似度评价、聚类分析、主成分分析等方法进行指纹图谱分析[13-21]，以期为浮小麦质量控制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

12批不同产地的浮小麦样品(表1)均从中药店采购。

表1 浮小麦样品的来源

乙腈、甲醇、磷酸(色谱级)：天津科密欧化学试剂公司；纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司；亚油酸(批号I1811018)：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；豆甾醇(批号C10206967)：上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 仪器与设备

LC-2030C Plus高效液相色谱仪:日本岛津公司；超声波清洗器:昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪:郑州长城科工贸易有限公司；多功能高速粉碎机:荷兰皇家飞利浦电子公司；电子分析天平:赛多斯科学仪器有限公司；高速冷冻离心机:赛默飞世尔(中国)科技公司；分样筛:浙江上虞五四仪器筛具厂。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液的制备

精确称取亚油酸、豆甾醇对照品适量，置于25 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容至刻度，即得含有540 μg/mL豆甾醇、720 μg/mL亚油酸混合对照品的溶液。

1.3.2 样品溶液的制备

精确称取浮小麦1.000 g(过50目筛)，置于50 mL离心管并加入甲醇25 mL，在500 W、60 kHz超声波下提取3次，每次30 min， 8 000 r/min离心15 min，取上清液，进行旋转蒸发，残渣加入甲醇溶解，转移至10 mL容量瓶，并用甲醇定容，过0.22 um微孔滤膜，即得样品溶液。

1.3.3 色谱条件

采用Material C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色谱柱进行分离，流动相为乙腈溶液(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0～10 min，45%-35% A；10～25 min，35%-25% A；25～40 min，25%-15% A；40～60 min，15%-10% A；60～70 min，10%-3% A)，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，测定波长203 nm，进样量20 μL。

1.3.4 数据处理

相似度评价采用“中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1为参照图谱。使用SPSS 25.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 方法学考察

2.1.1 精密度试验

取同一批S1样品溶液，按照1.3.3的色谱条件连续进样6次，以7号亚油酸为参照峰，考察仪器精密度。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为0.16%～1.89%、1.74%～2.22%，均小于3.00%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 稳定性试验

取同一批S1样品溶液6份，分别在0、2、6、8、12、24 h后按照1.3.3的色谱条件进样测定，以7号亚油酸为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和峰面积。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为1.23%～1.60%、1.01%～2.15%，均小于3.00%，说明样品溶液在制备24 h内稳定性良好。

2.1.3 重复性试验

取同一批S1样品溶液6份，按照1.3.3的色谱条件测定，以7号亚油酸为参照峰，计算其他共有峰的相对保留时间和峰面积。各共有峰相对保留时间和相对峰面积RSD分别为1.16%～1.25%、0.90%～1.90%，均小于3.00%，表明重复性良好。

2.2 指纹图谱的建立

将12批浮小麦的样品溶液在1.3.3的色谱条件下测定，将所得色谱图导入“中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)”，以S1样品色谱图为参照图谱，选择平均数法，时间宽度设置成0.1，多点校正后，进行共有峰自动匹配，生成样品对照指纹图谱和对照指纹图谱R，见图1、图2，其中12批不同产地浮小麦共有色谱峰16个。通过与对照品进行比对，7号峰为亚油酸，11号峰为豆甾醇，见图3。由于7号亚油酸峰分离度好，峰位居中，故以其为参照峰(S)计算其余共有峰的相对保留时间的RSD，均小于3.00%，表明共有峰的出峰时间较为稳定，但其相对峰面积的RSD相差较大，表明不同产地浮小麦中各个成分含量存在一定差异性，见表2。

表2 各共有峰相对峰面积

图1 12批浮小麦样品色谱峰匹配图

图2 浮小麦样品HPLC指纹图谱共有模式

图3 对照品HPLC色谱图

2.3 相似度评价

将12批浮小麦指纹图谱导入“中药指纹图谱相似度评价系统(2012版)”中，以S1为参照图谱进行相似度评价，结果见表3。12批不同产地浮小麦指纹图谱相似度为0.936～0.996，均大于0.9，整体相似度较高，表明浮小麦性质较为稳定。

表3 不同产地浮小麦HPLC指纹图谱的相似度

2.4 聚类分析

将12批样品共有峰的相对峰面积作为原始数据导入SPSS 25.0软件，采用平方欧式距离为样品间距离计算方法，对数据进行标准化转换，进行聚类分析，见图4。根据药材聚类分析结果，12批不同产地浮小麦可以被聚为3类，第1类: S8号样品；第2类: S1、S4、S10号样品；第3类: S2、S3、S5、S6、S7、S9、S11、S12号样品。表明生产产地相同或地理位置相似的样品被聚在一起，与相似度分析结果基本一致。

图4 不同产地浮小麦聚类分析

2.5 主成分分析

为了进一步探讨不同产地的浮小麦成分之间的差异性，在相似度和聚类分析的基础上，对指纹图谱所得到的16个共有峰的峰面积进行标准化处理，以标准化后的共有峰峰面积为变量，采用SPSS 25.0软件进行主成分分析，结果见表4。选取前4个特征值>1的成分为主成分对浮小麦指纹图谱进行描述，其累计方差贡献率为86.621%，能够较好地反映其化学成分特征。对主成分载荷值进行计算，得出主成分线性模型。并根据公式F=(0.33.642F1+0.272 64F2+0.179 75F3+0.077 40F4)/86.622(F代表主成分综合得分，F1、F2、F3、F4分别代表4个主成分得分)计算综合得分，见表5、表6。不同产地浮小麦综合得分为-5.78～5.76，若以16个共有成分为综合评价指标，其中山东、河南、山西浮小麦总体评分较高。主成分分析能把不同产地浮小麦分开，说明其质量存在差异。

表4 主成分特征值及累计方差贡献率

表5 主成分矩阵

表6 不同产地浮小麦主成分得分和综合得分

3 结论

从兼顾各个色谱峰的分离度、基线平稳度和色谱峰信息完全度出发，使用岛津HPLC二极管阵列检测器，考察了多个波长和4种不同体系的流动相，最终确定仪器检测条件：以乙腈-0.1%磷酸水做流动相，流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，在203 nm处进行指纹图谱扫描。对12种不同产地浮小麦建立了指纹图谱，其相似度为0.936～0.996，均大于0.9，可以表征浮小麦的特征属性。通过CA和PCA分析12批样品可聚为三类，其中山东、河南、山西产地浮小麦质量评价分数较高，其他地区浮小麦质量评价分数存在一定差异性，这可能与浮小麦生长环境、储存条件等因素有关。该指纹图谱的建立为浮小麦质量评价和合理应用提供了依据。