低聚原花青素对葡聚糖硫酸钠诱导小鼠溃疡性结肠炎的保护作用

吕晓楠，董 铮，李春进，曹义坡，李 颖，马 波，姚 旻

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)是一种慢性非特异性炎性反应性肠病，病变部位多在乙状结肠和直肠，好发于20～30岁青年人，常反复发作，很难治愈。遗传、免疫调节异常和环境等因素是UC的主要病因，炎性反应因子增多、氧化应激反应被认为是UC发病的关键[1, 2]。目前，UC治疗主要以5-氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制药为主，但效果欠佳，还可产生不同程度的不良反应[3, 4]。近年来，随着人们对天然产物提取物中活性成分研究的不断深入，发现以低聚原花青素(oligomeric proanthocyanidins，OPC)为代表的天然抗氧化剂，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等作用，并且口服OPC主要在结肠内降解，胃和小肠吸收较少[5-7]。但其是否可用于UC的治疗，也成为近期研究的热点。本研究通过探讨OPC对葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)诱导的UC小鼠的治疗作用及保护机制，旨在为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 OPC提取物(天津尖峰药业有限公司)；DSS(武汉欣欣佳丽生物科技有限公司)；4%多聚甲醛(北京鼎国昌盛生物技术有限公司)；MPO试剂盒(20160403，南京建成生物工程研究所)；美沙拉嗪(浙江华润三九众益制药有限公司)；Model 680酶标仪(Bio-RAD公司)。

1.2 实验动物 选取健康的8周龄雄性C57小鼠40只，体重20～25 g，由解放军军事医学科学院实验动物研究所提供。适应性饲养(自由采食、饮水)1周后，随机分为正常对照组、模型组、美沙拉嗪组、低剂量组和高剂量组，每组8只，分笼饲养。

1.3 方法

1.3.1 实验方法 正常对照组给予洁净水自由饮用，其他4组给予2.5%的DSS溶液自由饮用，共7 d。随后，正常对照组、模型组继续给予洁净水，美沙拉嗪组采用500 mg/kg美沙拉嗪灌胃，低剂量组给予500 mg/kg、高剂量组给予1000 mg/kg的OPC灌胃，连续给药7 d后处死小鼠，留取标本待测。

1.3.2 评估疾病活动指数(disease activity index, DAI) 每日观察小鼠的体重、大便形状和隐血情况，按表1的评分标准进行DAI 评分[8]。将体重下降、大便形状和隐血情况的评分相加，得出每只小鼠的评分，以评估疾病活动情况。DAI评分标准：(1)0分，体重无下降，大便形状正常，无大便隐血/肉眼血便；(2)1分，体重下降1%～5%，大便形状正常，无大便隐血/肉眼血便；(3)2分，体重下降6%～10%，大便形状松散，大便隐血阳性；(4)3分，体重下降11%～15%，大便形状松散，大便隐血阳性；(5)4分，体重下降>16%，大便形状为稀便，可见肉眼血便。

1.3.3 结肠病理变化及评估结肠大体形态损伤指数(colon macroscopic damage index，CMDI) 取近肛门端0.5 cm处直肠至盲肠的结肠段称重，测量长度，剖开观察溃疡及测量溃疡的大小。参照文献[9]标准进行CMDI评估。取近肛门端及有溃疡部位结肠组织进行固定，常规石蜡包埋，切片，HE染色，观察结肠组织病理变化。CMDI评分标准：(1)0分，无溃疡、炎性反应及肉芽组织，病变深度为0，无纤维化；(2)1分，溃疡<3 mm，轻度炎性反应，有肉芽组织，病变深度限于黏膜下层，轻度纤维化；(3)2分，溃疡>3 mm，重度炎性反应，病变深度达肌层，重度纤维化；(4)3分，病变深度达浆膜层。

1.3.4 血清IL-10水平测定 采用ELISA法， IL-10抗小鼠单克隆抗体100 μl(1 mg/ml，pH 7.4 PBS)包被96孔板，4 ℃孵育过夜后，洗板后加入100 μl的样品，在室温下孵育2 h，再加入0.2 μg/ml生物素标记的抗鼠抗体。在室温下孵育2 h后，洗板加入抗生物素蛋白过氧化物酶，孵育30 min，在37 ℃再次洗板后，加入ABTS底物。在405 nm波长处测定处使用自动微板酶标仪显色测定各孔的OD值。以标准品的OD值，绘制标准曲线，通过标本的OD值在曲线上计算其浓度。

1.3.5 MPO活性测定 剪取结肠近直肠端，称取50 mg，裂解为组织匀浆，匀浆液为磷酸缓冲液(50 mM，pH6.0，内含0.5%十六烷基溴化胺)，在冰上操作，8000 r/min离心5 min，匀浆液超声粉碎10 s，取上清，加入到邻联茴香胺盐酸盐溶液(50 mM，pH6.0，内含0.167 mg/ml邻联茴香胺和0.0005%过氧化氢)。根据试剂盒的方法测定MPO活性，在24 ℃采用自动微板酶标仪，在450 nm处测定吸光度(单位U/g)， 1 U对应1 min内所降解1 μmol过氧化氢的活性。

2 结 果

2.1 DAI评分 DSS造模后，从第3天开始小鼠出现大便异常，体重下降，第5天出现大便潜血阳性或者血便。同正常对照组相比，其他4组小鼠均有体重下降、大便形状改变和便血等情况，DAI评分明显升高，以模型组最为显著，差异有统计学意义(P<0.05)；同模型组相比，美沙拉嗪组、低剂量组和高剂量组小鼠的体重下降、大便形状和便血情况均有明显改善，DAI评分降低，高剂量组与美沙拉嗪组更为显著，差异具有统计学意义(P<0.05, 表1)。

2.2 结肠病理变化及CMDI评分 结肠长度方面，正常对照组小鼠结肠长度明显长于模型组，提示结肠萎缩程度最大，受到的炎性反应性损伤最为严重；美沙拉嗪组、低剂量组和高剂量组小鼠结肠萎缩程度均有改善，结肠病理表现也均有明显改善，且与剂量相关(图1)。与正常对照组相比，其他组小鼠结肠均出现不同程度的溃疡、炎性反应、肉芽组织增生和纤维化，CMDI评分均有升高，其中模型组和低剂量组与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)；而美沙拉嗪组和高剂量组CMDI评分与正常对照组相比差异无统计学意义。与模型组相比，美沙拉嗪组、低剂量组和高剂量组CMDI评分均降低，其中美沙拉嗪组、高剂量组差异具有统计学意义(P<0.05，表1)。

图1 各组小鼠治疗前结肠组织病理改变(HE，×100)

2.3 血清IL-10水平 与正常对照组相比，模型组、美沙拉嗪组、低剂量组小鼠血清IL-10水平均明显降低(P<0.05)，模型组降低最为明显；高剂量组与正常对照组接近，差异无统计学意义；与模型组相比，美沙拉嗪组、低剂量组及高剂量组血清IL-10水平均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

2.4 MPO活性测定 与正常对照组相比，其他4组小鼠MPO水平均明显增高，差异有统计学意义

(P<0.05)；与模型组相比，美沙拉嗪组和高剂量组的MPO水平均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，高剂量组的MPO水平甚至低于美沙拉嗪组(表1)。

表1 各组溃疡性结肠炎小鼠的相关指标比较

A.正常对照组(结肠黏膜表面偶见分泌物)；B.治疗对照组(接近正常对照组)；C.低剂量组(有淋巴细胞及巨噬细胞浸润，肠腺有萎缩，杯状细胞有减少)；D.高剂量组(淋巴细胞及巨噬细胞浸润减少，肠腺萎缩减轻)；E.模型组(黏膜变薄，上皮脱落，固有层有淋巴细胞及巨噬细胞浸润，肠腺萎缩，杯状细胞减少)

3 讨 论

UC是一种WHO确定的难治性疾病，近年来其发病率在我国呈上升趋势，因其难治愈、易复发，严重影响患者的生活质量。机体对氧自由基的清除能力下降和炎性反应介质的激活是UC重要的发病机制之一[10]。新型氨基水杨酸制药美沙拉嗪，通过增加炎性及免疫抑制因子释放和增加过氧化物酶合成，降低肠黏膜通透性，有缓解肠黏膜水肿的作用，但对于病情严重者疗效较差，且存在一定的不良反应[11]。天然抗氧化剂OPC具有保护心血管、改善疲劳、降血糖和血脂等功能，在临床广泛应用。有研究发现，OPC能够缓解DSS诱导的UC症状，其通过调节氧化应激相关蛋白Nrf2、HO-1和炎性反应通路蛋白NF-κB 的表达，进而影响SOD、MDA来减轻结肠组织的病理损伤[12]。然而OPC是否还影响其他的氧化应激通路，仍需进一步探讨。近年来在炎性疾病中IL-10和MPO的作用日益受到关注，因此本研究观察OPC对DSS 诱导的UC大鼠IL-10和MPO的变化，探讨OPC对UC可能的作用机制。

OPC是植物中广泛存在的天然抗氧化物质，在葡萄、大黄、银杏等植物中含量较高。OPC分子结构中含有富电子的羟基，是氢或中子良好的给予体，具有超强的抗氧化能力，能有效清除人体内自由基。每分子OPC最多可以捕获8个氧自由基，其抗自由基能力是维生素E的50倍，是维生素C的20倍，因此具有细胞保护、抗衰老、抗炎和抗肿瘤等作用[13]，为以氧化应激为发病机制的疾病治疗提供了良好的选择。本研究应用低剂量和高剂量的OPC对UC小鼠模型进行干预治疗，并与常规的美沙拉嗪治疗对比。结果发现，OPC干预后的小鼠无论是疾病活动指数还是大体形态损伤指数均有明显改善，血清IL-10明显升高，组织MPO明显降低，尤其是高剂量组，与美沙拉嗪治疗的结果类似，均最接近于正常对照组。说明高剂量OPC对小鼠UC治疗有效，对结肠病理损伤和炎性反应指标的改善作用类似于常用药物美沙拉嗪。

IL-10是一种炎性反应和免疫抑制因子，由肠黏膜Treg细胞亚群分泌，能抑制单核巨噬细胞的化学趋化作用和特异性免疫功能，同时增强细胞的免疫耐受诱导和清道夫功能。IL-10还能联合TGF-β产生广泛的非特异性抗炎作用[14]。本研究结果发现，模型组的血清IL-10表达水平低于正常对照组，说明在UC小鼠体内与IL-10相关的抗炎作用降低。在给予美沙拉嗪或OPC干预后，尤其在高剂量组血清IL-10水平升高水平接近于正常对照组，说明OPC可能通过促进肠黏膜Treg细胞亚群的IL-10分泌，缓解炎性反应程度，发挥对UC的治疗作用。

MPO是一种血红素蛋白，富含于中性粒细胞中。在炎性反应过程中，MPO以氯和过氧化氢为底物，催化产生次氯酸等反应性物质和多种自由基，在炎性反应和氧化应激反应中发挥重要作用。MPO已成为评价心血管疾病危险性的重要指标之一，但对于UC等肠道疾病的相关研究较少[15]。本研究发现，UC模型组的MPO表达水平高于正常对照组，说明其组织内炎性反应和氧化应激反应增加。在给予美沙拉嗪或OPC干预后，组织MPO降低，尤其是高剂量OPC组降低幅度最大，接近于美沙拉嗪组，说明OPC可能通过抑制MPO的分泌，缓解炎性反应程度和氧化应激反应，减轻疾病损伤。

综上所述，本研究发现，在DSS诱导的UC小鼠模型中，高剂量OPC可产生与美沙拉嗪相似的疗效，其机制可能是通过影响MPO和IL-10降低氧化应激，缓解炎性反应，发挥抗炎和抗氧化作用，减轻结肠黏膜损伤，获得治疗效果。证明OPC作为天然的抗氧化剂，具有良好的临床应用前景。然而，UC的发病机制复杂，本研究仅从动物实验阶段进行了初步探讨，OPC对临床UC患者的疗效及应用剂量还需进一步深入研究。