消痰化瘀利窍方对慢性间歇性低氧小鼠认知障碍的改善作用*

赵 洋， 杨胜昌， 于富洋， 李文雅， 吉恩生

(河北中医学院生理教研室， 石家庄 050200)

阻塞性呼吸睡眠暂停(obstructive sleep apnea，OSA)是一个由睡眠期间上呼吸道反复塌陷导致的睡眠障碍疾病，表现为打鼾、睡眠片段化、日间乏力、嗜睡等[1]。流行病学报道称15%～24%的成年人存在不同程度的OSA，在一项5年的随访中，OSA患者罹患痴呆的风险是非OSA患者的1.7倍[2,3]。临床研究还发现OSA患者存在明显的注意力下降以及学习和记忆能力损伤，严重影响日常的学习和工作[4]。我们先前的动物模型结果也表现出显著的行为学成绩下降[5]。慢性间歇性低氧(chronic intermittent hypoxia, CIH)是OSA最主要的病理特征，有研究表明长期的低氧/复氧可能是导致认知障碍的主要原因[6]。海马功能和结构的完整性对于学习和记忆具有至关重要的作用[7]。CIH暴露可破坏海马神经元和突触结构的完整性，导致突触后致密物质受损和突触素丢失，影响神经元之间的信息传递，损害学习和记忆功能[8,9]。

临床上针对OSA的治疗方法主要有持续正压通气，口腔矫正以及手术治疗等，但依然存在治疗反复、患者依从性差等问题。相比之下，传统医学具有简便效廉的特点。据我们先前的研究结果表明，消痰化瘀利窍方对CIH诱导的大鼠心功能不全具有良好的改善作用[10]。本研究通过建立CIH小鼠模型，明确消痰化瘀利窍方对CIH诱导的小鼠认知障碍的改善作用，探讨复方对CIH暴露小鼠海马神经元突触结构损伤以及突触相关蛋白表达的作用机制。本研究以OSA患者“痰、虚、瘀”中医辨证为基础，以期寻求改善慢性间歇性低氧诱发认知障碍的新措施。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性C57小鼠48只，体重20～25 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。随机平均分成四组(n=12)：常氧对照组(Normoxia)，慢性间歇性低氧组(CIH)、慢性间歇性低氧中药干预组(Formula+CIH)、中药对照组(Formula)。将CIH及Formula+CIH组暴露于动物慢性间歇性低氧装置，前1.5 min向舱内充入100%氮气使O2浓度降至9%，后1.5 min充入医用氧(>99.5%)使O2浓度升至21%，每一循环3 min，每天8: 00 am-4: 00 pm上舱8 h，共35 d。Normoxia及Formula组大鼠置于低氧舱内，但向舱内充入空气。同时，Formula+CIH与Formula组于每天8: 00前灌胃前Formula+CIH与Formula组给予消痰化瘀利窍方灌胃(生药量26.8 g/kg以中药药理研究方法学的小鼠与人药物剂量折算方法折算临床剂量)，CIH与Normoxia组灌服同体积生理盐水。各组小鼠于造模26～35 d进行水迷宫实验，35 d造模结束后应用Y-迷宫进行行为学测定，然后断头分离海马组织，部分用多聚甲醛固定，用于尼氏染色和透射电镜观察结构变化，另一部分冻存于-80℃冰箱用于Western blot检测蛋白表达情况。

1.2 主要试剂与仪器

消痰化瘀利窍方由丹参30 g，法半夏12 g，陈皮10 g，茯苓15 g，生黄芪15 g，炒白术12 g，石菖蒲12 g，郁金12 g，射干12 g，白芥子10 g，桔梗12 g，枳壳15 g，川芎12 g，赤芍15 g，地龙12 g组成，以水煮醇沉法制备,含生药1.1 g/ml，中药材购自于神威药业集团有限公司；尼氏染色液和电镜专用2.5%戊二醛固定液(武汉塞维尔生物科技有限公司)；synapsin(proteintech，17785-1-AP)和PSD-95抗体(Servicebio，GB11277)；β-Tubulin(Servicebio，GB13017-2)；HRP标记山羊抗兔IgG(Servicebio，GB23303)和HRP标记山羊抗小鼠IgG(Servicebio，GB23301)；BCA蛋白定量试剂盒(康为世纪，CW0014S)。动物间歇性低氧装置(Oxycycler Model A84, BioSpherix)。

1.3 Morris水迷宫实验

于造模26～35 d进行连续10 d的水迷宫行为学检测，包括定向航行实验和空间探索实验。第1～5日进行隐藏平台实验(hidden platform training)，每只小鼠大鼠每天训练4次，分别从4个不同入水点面壁入水，记录分析小鼠在训练期间找到平台的时间( 潜伏期)；第6日撤去平台进行第1次空间探索实验，记录小鼠60 s 内于原平台所在象限的探索时间百分比。第7～9日进行反转平台实验(reversal platform training)，第10日撤去平台进行第2次空间探索实验。同时，进行可见平台实验，以排除小鼠的游泳能力和视力对行为学的影响。

1.4 Y-迷宫实验

造模结束后，进行Y-迷宫行为学测定。Y-迷宫由一个中心区域和周围连接的三条完全相同的封闭臂组成，三臂互为120°角，呈三等分辐射状。将三臂分别命名为A，B和C，将每只小鼠放于中心区域，允许小鼠自由探索5 min。计录5 min内小鼠进入三条臂的总次数以及正确次数(连续三次进入无重复臂)，以正确次数评价动物的Y-迷宫成绩。

1.5 组织病理学观察

造模结束后，取出大脑并用4%多聚甲醛固定，脱水、石蜡包埋、切片，进行尼氏染色。分离海马组织置于2.5%戊二醛溶液中，包埋、切片，于电镜下观察突触后致密物质的厚度。

1.6 Western blot检测synapsin和PSD-95的表达

分离海马组织，按100 mg/ml加入蛋白裂解液，超声破碎后，离心(12 000 r/min,15 min,4℃)取上清，BCA测定蛋白浓度。蛋白变性后，-80℃保存待用。电泳(80 V，40 min；160 V，90 min)结束后，进行半干转(22 V，28 min)。5%脱脂牛奶封闭120 min,TBST清洗三次，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育过夜。次日，TBST清洗三次，加入相应二抗(1∶ 5 000)孵育120 min。TBST清洗三次后，应用ECL发光显色并拍照。采用Quantity One分析软件进行灰度分析。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 消痰化瘀利窍方对CIH小鼠水迷宫成绩的影响

水迷宫实验结果显示，与Normoxia组相比，中药对照组小鼠水迷宫的成绩无明显变化，CIH组小鼠在隐藏平台和反转平台实验中的潜伏期明显延长(P<0.01，P<0.01)，在空间探索实验中的目标象限时间百分比明显下降(P<0.01，P<0.01)，提示CIH可诱导小鼠学习和记忆能力明显下降。而消痰化瘀利窍方干预能明显提高CIH小鼠的水迷宫成绩(P<0.01，图1，表1)。

Fig. 1 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Morris water maze performance in mice exposed to CIH

Tab. 1 Time spent in the target quadrant in the probe test (s, n=6)

2.2 消痰化瘀利窍方对CIH小鼠Y-迷宫成绩的影响

Y-迷宫实验结果显示，与Normoxia组相比，中药对照组小鼠对Y-迷宫的成绩无明显变化，CIH组小鼠总进臂次数无明显变化，但是正确次数明显下降(P<0.01)，而消痰化瘀利窍方干预能明显增加CIH小鼠的正确次数(P<0.01，表2) 。

2.3 消痰化瘀利窍方对CIH小鼠海马神经元损伤的影响

尼氏染色结果显示，与Normoxia组相比，中药对照组海马尼氏小体数量无明显变化，CIH组小鼠海马神经元染色变浅，尼氏小体数量减少。与CIH组相比，消痰化瘀利窍方干预可减轻海马神经元的损伤(图2)。

Tab. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on Y-maze performance in mice exposed to CIH n=6)

Fig. 2 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on hippocampal neuron injury in mice exposed to CIH(Nissl staining ×400)

2.4 消痰化瘀利窍方对CIH小鼠突触后致密物厚度的影响

电镜结果显示，与Normoxia组相比，中药对照组突触后致密物质的厚度无明显变化，CIH组小鼠海马神经元突触后致密物质厚度减少，而消痰化瘀利窍方干预可明显增加突触后致密物厚度(图3)。

Fig. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on postsynaptic density thickness in mice exposed to CIH(Transmission Electron Microscope ×25 000)

2.5 消痰化瘀利窍方对CIH小鼠海马神经元synapsin和 PSD-95水平的影响

与Normoxia组相比，中药对照组海马synapsin和 PSD-95的表达无明显变化，CIH组小鼠PSD-95水平显著降低(P<0.01)，消痰化瘀利窍方干预可明显上调PSD-95的表达，与CIH组大鼠相比具有统计学意义(P<0.01)。而synapsin蛋白的表达在各组之间无明显差异(图4，表3)。

Fig. 4 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus

Tab. 3 Effects of Xiaotan Huayu Liqiao Formula on synapsin and PSD-95 expressions in hippocampus n=6)

3 讨论

据统计，在发达国家和发展中国家有5%～7%的人群患有OSA，而在临床上超过70%的OSA患者表现出认知障碍，如学习和记忆功能受损等[11,12]。研究表明，大脑遭受长期的低氧/复氧可造成海马神经元的丧失[13]，影响突触可塑性，进而引起记忆能力减退和认知功能障碍。本研究通过建立CIH小鼠模型评估其行为学的改变，观察形态学以及相关的分子表达。发现在CIH暴露后，小鼠水迷宫和Y-迷宫成绩明显下降，尼氏染色显示海马神经元染色变浅，电镜观测可见突触后致密物减少，Western结果显示PSD-95表达明显减少。而给予消痰化瘀利窍方干预可明显改善CIH 诱导小鼠的认知障碍以及海马神经元结构和功能的损伤。

水迷宫通常用于评估空间参考记忆和学习功能。与以往研究一致[5]，我们发现慢性间歇性低氧暴露小鼠在目标象限停留时间减少和逃避潜伏期时间延长。消痰化瘀利窍方干预可明显提高CIH小鼠的水迷宫成绩。由于工作记忆是记忆执行的重要组成部分，联合应用Y-迷宫评估小鼠认知功能的影响将更为客观。结果显示，消痰化瘀利窍方干预可明显增加CIH小鼠在Y-迷宫中的正确进臂次数。提示，消痰化瘀利窍方可以改善CIH诱导的学习和记忆功能障碍。中医学认为心与神志密不可分，《素问·灵兰秘典论》曰“心者，君主之官，神明出焉”。而《素问·脉要精微论》中提出“头者，精明之府”，《本草备要》也提到“人之记性，皆在脑者”。又把脑与神志、记忆功能联系起来。同时，脑为髓海，心主血脉而藏神，由于精血同源，脑髓与心血互相滋养，正如孙沛所言“故性动而灵，脑赖心血养之”[14]。所以祖国医学在治疗精神以及认知疾病时常用养血补心，豁痰通窍的方法[15]。消痰化瘀利窍方具有活血祛瘀，豁痰通窍的功效，对于慢性间歇性低氧引起的认知功能障碍恰合病机。

海马是学习和记忆的关键结构，尤其对睡眠期间长时间的低氧/复氧非常敏感，该脑区神经元的损伤可导致啮齿动物出现显著的认知缺陷[7,16]。我们通过尼式染色结果观测到消痰化瘀利窍方可改善CIH暴露后的海马神经元损伤。突触后致密物(postsynaptic density，PSD)是突触后膜的一层均质致密物，是反映突触可塑性的形态学参数[17]。我们应用透射电镜观测到CIH组小鼠海马神经元突触后致密物厚度明显低于对照组，而消痰化瘀利窍方干预可明显增加突触后致密物厚度。由此可见，消痰化瘀利窍方可能通过改善海马神经元损伤进而发挥对CIH诱导认知功能障碍的保护作用。

PSD-95是突触后致密区 (PSD) 的一种重要的神经细胞骨架蛋白，可以与离子通道，膜受体和细胞内信号分子等相互作用，调节突触可塑性[18]。Ehrlich I[9]等认为，在学习期间PSD-95表达水平在突触位点特异性的增加诱导了突触可塑性的升高。而 PSD-95表达水平下降则与认知障碍密切相关[19]。本实验结果显示CIH暴露可导致PSD-95表达下调，而对突触素的表达无明显影响。消痰化瘀利窍方干预可明显上调CIH暴露小鼠PSD-95的表达水平。

同时，本研究发现单独给予消痰化瘀利窍方对小鼠的学习记忆能力以及突触可塑性无明显作用，也不影响synapsin和PSD-95蛋白的表达。提示消痰化瘀利窍方对正常小鼠的学习记忆功能无明显影响。消痰化瘀利窍方是通过上调CIH诱导的PSD-95表达下降改善CIH 诱导海马神经元突触后可塑性下降，进而改善CIH暴露小鼠的认知功能障碍。

综上，消痰化瘀利窍方干预可通过增加突触后致密物质厚度以及上调PSD-95蛋白的表达水平，改善CIH诱导的认知功能障碍。而针对OSA“痰、虚、瘀”的中医病机[20]，通过活血祛瘀，豁痰通窍的治法，可为临床改善OSA诱发认知功能障碍的中医药防治提供理论基础和实验依据。