不同时间点针刺对穴区HSP27、MAP4的影响＊

韦 婷，白艾灵，王 宇，刘 祎，赵征宇，蔡定均

（成都中医药大学针灸推拿学院 成都 610037）

针灸治疗疼痛疗效肯定，其镇痛效果已经得到了世界公认[1-2]。据美国自然神经科学杂志[3]报道，针灸可以促使穴位局部释放一些天然的止痛物质，最终达到镇痛的目的。针刺镇痛具有明显的时间差异特性，中医的传统时间针灸方法，如子午流注针法、灵龟八法用于痛证治疗已取得良好疗效[4-5]。现代研究认为，针灸镇痛的时间效应与5-羟色胺和去甲肾上腺素[6]、香草酸瞬时电位受体4[7]、P2X3 受体[8]及穴区嘌呤信号[9]等有关。但目前尚缺乏细胞骨架相关分子对不同时间点针刺镇痛效应影响的研究。针刺可以使穴区局部微环境发生改变，引起局部神经感受器的兴奋、细胞功能的激活、各种相关化学物质的释放以及其相互作用形成针刺局部反应小网络，发挥针刺镇痛等效应，进而调节机体失衡状态[10-12]。成纤维细胞作为皮下结缔组织中主要的感受性和效应性细胞，在针刺力学转化过程中起着至关重要的作用。此外，成纤维细胞具有独立振荡作用的外周生物钟，该自主生物钟对肌动蛋白细胞骨架施加节律性调节，驱动自身节律的运行[13-14]。本课题组前期在针刺镇痛时间效应的研究中发现，不同时间点针刺对大鼠佐剂性关节炎痛阈的影响不同，在ZT12 和ZT16 时间点针刺均具有明显的镇痛效应，且该效应具有时间差异[9]。进一步研究发现，这种镇痛时间效应差异的产生与针刺调整穴区局部成纤维细胞骨架蛋白有关，不同时间点针刺对成纤维细胞骨架重构的作用以及对其蛋白表达量的影响不同，其中在ZT12和ZT16时间点，成纤维细胞骨架形态改变具有显著差异[15]。那么针刺镇痛的不同时间效应是如何影响成纤维细胞骨架重构的，仍有待进一步研究。

引起成纤维细胞骨架重构中间环节的力-化学信号转导过程受多种蛋白的调控。其中热休克蛋白27（heat shock protein，HSP27），不仅参与细胞的增殖、分化和细胞凋亡等信号转导的调节，同时具有保护细胞免受各种应激因素损伤，促进蛋白质正确折叠的功能[16-17]。此外，微管相关蛋白4（microtubule associated protein 4，MAP4）是一种广泛表达于全身组织的微管动力学调节蛋白，其能促进微管聚合，维持细胞骨架和连接结构的完整，在维持微管稳定方面起着重要的作用[18]。基于此，本研究选择时间针灸效应明确的痛证为载体，拟观察在ZT12、ZT16 两个时间点针刺对成纤维细胞骨架调控相关蛋白分子的变化，从而探讨不同时间针刺对成纤维细胞骨架调控的相关原理，以期揭示针刺时间效应的始动机制，为择时针刺镇痛提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组

清洁级雄性SD 大鼠，7-8 周龄，体质量200 ± 20 g，四川省医学科学院实验动物研究所提供，许可证号：SCXK（川）2013-15。于成都中医药大学时间生物医学节律室的隔离单元内进行大鼠驯化。自动光暗控制，7:00-19:00 为光照期，室温22℃±1℃，相对湿度50%-60%，每隔1 小时自动通风1 次。经1 周驯化后，选取光暗周期同步的大鼠，采用疼痛甩尾测试仪进行痛阈基础值的测定和筛选，纳入筛选标准：在3-10 s之间的辐射热可引起甩尾反应者。然后将筛选留用的36 只大鼠，根据痛阈值完全随机分为造模组24 只，空白组12 只。造模成功的大鼠以痛阈值随机分为针刺组和模型组，每组12只。根据针刺时间点的不同又分为ZT12（19:00）、ZT16（23:00）（ZT0 开灯时间7:00，ZT12关灯时间19:00）2个时间亚组。每个对应时间点各18只，随机为空白组、模型组和针刺组，每组6只。

1.2 主要试剂与设备

完全弗氏佐剂（CFA，批号：101M8711，美国Sigma公司）；BCA 蛋白浓度测定试剂盒（批号：KGP903，南京凯基生物公司）；预染蛋白Marker（批号：00215343，美国NEB公司）；ECL发光试剂盒（批号：BL520A，美国Thermo 公司）；Anti-HSP27 抗体（批号：ab109376）、Anti-MAP4 抗体（批号：ab232947）、Anti-β-actin 抗体（批号：ab8227）和山羊抗兔IgG（H+L）（批号：ab6721）均由英国abcam 公司生产。疼痛甩尾测试仪（型号：7360 型，UGOBASILES． R． L，意 大 利Biological Research Apparatus）；DYY-6C 电 泳 仪、ChemiDoc XRS+Systems 凝胶扫描成像仪以及化学发光凝胶成像仪均由美国BIO-RAD 公司提供；TGL-16G-A 型高速低温离心机由上海安亭科学仪器厂生产。

1.3 模型复制

在ZT12 和ZT16 两个时间点进行模型复制，造模组24 只大鼠在右侧足垫部皮内注射CFA 0.1 ml，每个时间点各12只；空白组12只大鼠注射生理盐水0.1 ml，每个时间点各6 只。24 h 后，造模组大鼠右后足爪明显肿胀，活动受限跛行，辐射热甩尾测定大鼠痛阈潜伏期缩短，表明造模成功。

1.4 治疗方法

采用自制大鼠固定器固定大鼠，在ZT12、ZT16 对针刺组大鼠进行针刺治疗，选择大鼠右侧“足三里”穴（ST36），消毒后直刺7 mm，留针30 min，每5 min 采用捻转平补平泻法行针1次，每次1 min，频率120次/min，1 次/d，治疗7 d。对两个时间点的其余组大鼠用相同方法抓取及固定30 min。

1.5 观察指标及检测方法

免 疫 印 迹 法（Western blot）测 定 穴 区HSP27、MAP4 蛋白表达：针刺治疗结束后，股动脉放血法处死大鼠，提取大鼠患侧足三里局部的皮肤和皮下组织，裂解液裂解10 min，12 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA法测定样品蛋白浓度，经蛋白定量后，煮沸10 min变性蛋白，电泳，转膜，切膜，TBS 浸湿膜后，封闭1 h，膜上滴加一抗，4℃过夜，滴加二抗，孵育2 h，经ECL化学发光法检测蛋白条带。结果以目的蛋白相对表达量表示（目的蛋白相对表达量=目的蛋白积分光密度值（IOD）/内参积分光密度值（IOD）。

1.6 统计学处理

采用统计软件SPSS 21.0进行数据分析，数据以均数±标准差（xˉ±s）来描述，经过正态分布和方差齐性检验后，各组间比较用单因素方差分析，方差齐者采用LSD 法，方差不齐者采用Tamhane's T2 法，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

图1 ZT12、ZT16两个时间点各组大鼠穴区皮肤HSP27蛋白表达量

表1 主体间效应的检验（因变量:针刺组HSP27）

2.1 不同时间点针刺对大鼠穴区HSP27 蛋白表达量的影响

针刺大鼠足三里7 天后，由图1 结果所示，相同时间点不同组间比较：在ZT12 时间点，模型组HSP27 蛋白表达量较空白组明显增高（P＜0.05）；针刺组HSP27表达量较模型组明显降低（P＜0.05）。在ZT16 时间点，模型组HSP27 表达量较空白组明显增高（P＜0.05）。不同时间点相同组间比较：在空白组与针刺组中，ZT16 时间点HSP27 表达量较ZT12 时间点显著增高（P＜0.01）。为排除不同时间点造模对针刺组HSP27 蛋白表达的混杂影响，故将两个时间点模型组的HSP27 蛋白表达量纳入协变量，运用协方差分析不同时间针刺对HSP27 蛋白的调整力度。如表1 和图2所示，不同时间点造模对针刺组HSP27 蛋白表达具有显著的影响（P＜0.01），在排除不同时间点造模对针刺调节作用的干扰后，在两个不同时间点针刺对HSP27 蛋白表达量的影响仍然存在显著的差异（P＜0.01），且ZT16 时间针刺对该蛋白的调整幅度大于ZT12时间点。

图2 不同时间点针刺对HSP27的调整幅度

图3 ZT12、ZT16两个时间点各组大鼠穴区皮肤MAP4蛋白表达量

2.2 不同时间点针刺对大鼠穴区MAP4 蛋白表达量的影响

针刺治疗7 天后，由图3 结果所示，相同时间点不同组间比较：在ZT12 时间点，模型组大鼠穴区MAP4表达量较空白组明显增高（P＜0.05）；不同时间点相同组间比较：空白组ZT16 时间点大鼠穴区MAP4 表达量较ZT12 时间点明显增高（P＜0.05）；针刺组大鼠穴区MAP4 表达量ZT16 时间点较ZT12 时间点明显增高（P＜0.05）。为排除不同时间点造模对针刺组MAP4蛋白表达的混杂影响，将两个时间点模型组的MAP4蛋白表达量纳入协变量，运用协方差分析不同时间针刺对MAP4蛋白的调整力度。如表2和图4所示，不同时间点造模对针刺组MAP4蛋白表达具有显著的影响（P＜0.01），在排除不同时间点造模对针刺调节作用的干扰后，在两个不同时间点针刺对MAP4 蛋白表达量的影响仍然存在明显的差异（P＜0.05），且ZT16 时间点针刺对MAP4 蛋白表达量的调整幅度大于ZT12时间点。

表2 主体间效应的检验（因变量:针刺组MAP4）

图4 不同时间点针刺对MAP4的调整幅度

3 讨论

HSP27 蛋白是HSP 亚家族中的重要一员，在生物体内参与多种复杂的功能活动，并反映出不同的生物学效应，能够调节多种信号转导通路，具有细胞保护作用。磷酸化的HSP27 可能介导血管紧张素II 与血小板衍生生长因子诱导的血管平滑肌细胞的骨架重建和迁移，并且具有促进微丝形成和稳定黏着斑的作用，这对促进细胞迁移有着重要作用[19-20]。有研究发现，在急性胰腺炎早期，氧化应激损伤降低了细胞骨架的稳定性，同时HSP27 蛋白及其磷酸化蛋白被激活，从而发挥对胰腺细胞骨架稳定性的保护作用[21]。各种对细胞有害的应激环境能够诱导细胞骨架的重组或破坏，p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）信号转导通路使HSP27 发生磷酸化，磷酸化的HSP27 参与调控细胞骨架重组，稳定细胞骨架结构[22]。也有研究认为，HSP27 的磷酸化主要受蛋白激酶D（PKD）的激活，从而发挥对缺血性损伤后的神经保护作用[23]。本课题组研究发现，在ZT12 和ZT16 时间点复制佐剂型关节炎疼痛模型，导致这两个时间点大鼠穴区皮肤中HSP27 蛋白表达应激性增加，针刺治疗后能明显降低ZT12 时间点HSP27 蛋白表达；在不同时间点针刺对HSP27的蛋白调整作用不同，其中在ZT16时间点针刺对该蛋白表达的调整幅度大于ZT12时间点。

MAP4 是微管相关蛋白的一种，具有调节微管排列、促进微管组装、交联微管和肌动蛋白等生理功能。MAP4 包被在微管外部时，微管蛋白亚单位不能脱离微管的末端，从而起到了稳定微管的作用。MAP4 既可以独立引起微管解聚，又能协同相关蛋白通道共同作用于微管，影响细胞骨架重构。体内外研究均显示MAP4 能增强微管蛋白聚合和整体微管的稳定性[24]。MAP4主要通过两种途径促进微管的稳定性：①通过捆绑微管并促进对外力的抵抗；②通过结合微管和空间阻断主动分解微管的蛋白质[25]。MAP4 的磷酸化诱导MAP4从微管中脱离，使微管细胞骨架失稳。缺氧导致心肌细胞微管结构遭到破坏并激活p38MAPK 信号传导通路，使MAP4磷酸化增加，从而诱导微管细胞骨架解聚并降低细胞活性[26-27]。炎性条件下，肺内皮屏障功能障碍使MAP4 磷酸化伴随p38MAPK 信号途径的激活而增加，从而诱导微管解聚，使肺血管通透性增高[18]。本课题组的研究结果发现，在ZT12和ZT16时间点复制佐剂型关节炎疼痛模型，导致ZT12时间点大鼠穴区皮肤中MAP4 蛋白表达应激性增加；在不同时间点针刺对MAP4 的蛋白调整作用不同，其中在ZT16 时间点针刺对该蛋白表达的调整幅度大于ZT12时间点。

HSP27 和MAP4 在细胞骨架的调控过程中发挥至关重要的作用。细胞化学信号的产生依赖于细胞骨架将机械信号传导至细胞核，成纤维细胞作为应力细胞，能感知和传导机械力刺激，将其转化为力学信号从而导致细胞产生一系列生物效应[28-29]。成纤维细胞的这种信号转导作用得力于其细胞骨架的感受器作用，细胞骨架是一组由纤维结构组成的蛋白网状支架，由微丝、微管及中间丝构成。机械力作用于成纤维细胞引起的细胞骨架重构及形态变化参与信号传导。针刺作用属于物理力学刺激的一种，能够将刺激作用转换为生物化学信号，对成纤维细胞骨架、形态以及其相关生长因子进行调节[30-31]。已有研究表明，针刺对成纤维细胞骨架重构及其骨架蛋白具有明确的调整作用，且这种效应具有时间差异[15]。本研究在前期不同时间点针刺对镇痛效应不同的研究基础上[7-9,15]，选择针灸镇痛效应具有明显差异的两个时间点，即ZT12和ZT16时间点，通过比较这两个时间点针刺对穴区皮肤中HSP27 和MAP4 蛋白表达量的差异，探讨其对成纤维细胞骨架调控的相关原理，以期揭示针刺时间效应的始动机制，为针刺镇痛的择时治疗提供依据。本研究发现，在ZT12和ZT16两个时间点，针刺在相同时间点不同组间以及不同时间点相同组间，对HSP27 和MAP4 蛋白表达均具有不同的调节作用，并且在ZT16时间点，针刺对HSP27、MAP4蛋白表达量的调整作用均大于ZT12时间点。因此本课题组推测，针刺通过对穴区HSP27、MAP4 蛋白表达的调整，从而影响成纤维细胞骨架重构的改变，在不同时间点ZT12、ZT16针刺对穴区成纤维细胞骨架重构的不同调控效应，可能与这两个时间点针刺对骨架蛋白表达相关信号分子HSP27、MAP4 的调整作用不同有关，从而发挥不同的镇痛效应。