垂黄清脉冲剂干预治疗冠心病稳定型心绞痛热毒痰瘀证患者NF-κB信号通路的研究＊

赵 凯，叶晓辉

（1. 宁夏医科大学总医院 银川 750004； 2. 西安国际医学中心医院 西安 710010）

冠心病（coronary atherosclerotic heart disease,CAD）是动脉粥样硬化导致机体器官病变中最常见的一种类型，主要是由脂质代谢障碍形成动脉粥样硬化斑块导致冠状动脉管腔狭窄或闭塞不通使心肌发生缺血、缺氧或坏死而引发的心脏病。稳定型心绞痛是最常见、最具代表性的心绞痛类型，指由心肌缺血缺氧引起前胸阵发性的压榨性窒息样感觉，主要位于胸骨后，可放射至心前区和左上肢尺侧面、右臂和两臂的桡侧面或颈部与下颌部，持续数分钟，往往在休息或舌下含服硝酸甘油后症状迅速消失。其临床表现在1-3 个月内相对稳定，发作频率、疼痛程度、持续时间以及缓解方式等相对比较固定，斑块也不易破裂。以男性多见，40岁以上人群多发。病因主要为冠状动脉粥样硬化引起，还可由主动脉瓣狭窄或关闭不全、梅毒性主动脉炎、肥厚性心肌病等，劳力、情绪激动、饱餐、受寒等是常见诱因。近年来，人类的膳食结构和生活方式随着社会和经济的不断发展而发生着巨大改变。致使冠心病的发病率和死亡率正在全球范围内迅速増加上升，且发病人群越来越趋于低龄化[1]。2017 年全球疾病负担国际合作研究报告[2]表明，冠心病患病人数估计值为1.1 亿，仍处于不断上升趋势，是目前全球第一大“死亡杀手”。每年因冠心病死亡人数约为892万。2018年中国疾病预防控制中心研究报告[3]数据显示，从1990 年到2013 年，由冠心病导致死亡在总死亡中所占比例由8.6%增加至15.2%，在所有心血管疾病死亡中所占比例由29%增加至37%。该研究根据1990 年冠心病死亡人数估算出2013 年中国冠心病死亡总人数为139.4万，较1990年增加了90%。多项研究结果也显示，我国冠心病的发病和死亡人数将随着人口老龄化进程的加剧而不断增加。

中医学中无“冠状动脉”一词的记载，古医籍中也未出现对冠状动脉粥样硬化的论述，故中医学中并无冠心病病名。中医文献中根据解剖部位、疼痛性质及程度、持续时间等综合后将冠心病归属于“胸痹心痛”范畴[4]。张仲景《金匮要略·胸痹心痛短气病脉证治》中总结病机为“阳微阴弦”，即心气、心阳虚弱为本虚，寒凝、气滞、血瘀、痰饮等病理因素为标实。随着经济的高速发展，现代人生活方式也发生着巨大改变。喜食肉类肥甘厚味，嗜食辛辣炙煿之品等这些不良饮食习惯，损伤脾胃，痰浊内生，郁而化火；“五志过极皆为热病”情志内伤亦可化火；心理压力大，生活节奏快，嗜烟饮酒成瘾，吸烟与高血压、高胆固醇血症、糖尿病、年龄、遗传并称为导致冠心病发生的六大独立危险因素；冠心病患者大多高龄阴血亏耗，长期服用香窜温燥药物或滥用保健品，尤其是人参类温补过度，更宜阴虚火旺，灼伤阴血，化生毒热；现代人体质偏阴虚阳热者越来越多，肥胖、血压高、血脂高、血糖高、血黏高、负荷高、免疫力低，体内脂、糖、痰、浊、瘀毒蕴结蓄积不出。此外环境污染中的废水、废气、工业垃圾、全球气温变暖、复杂耐药的病原微生物感染等，更易致火热之邪侵入体内，蕴结日久化成热毒，伤津劫液，灼伤营血，损伤心络，痹阻心脉而发病。

随着冠心病热毒痰瘀病机学说与动脉粥样硬化炎症反应研究的不断深入，部分学者总结出动脉粥样硬化和冠心病中的炎症反应机制可归属于中医“毒邪学说”中的内毒和外毒范畴[5]；血脂高、血黏高、尿酸高等状态和氧自由基、内皮功能损伤以及脂代谢紊乱可归结为痰瘀胶结互阻久郁化热，损伤脉络所致，综合形成了热毒痰瘀证的病机。有研究表明[6]动脉粥样硬化的形成中血管内皮损伤，脂质沉积的过程相当于痰浊证，内皮细胞损伤，血小板聚集，血液高凝状态相当于血瘀证。脂质浸润、炎症损伤反应以及血小板聚集等学说与中医痰、瘀互结理论相符[7]。本研究通过我院经临床诊断收治的94 例冠心病稳定型心绞痛热毒痰瘀证患者为研究对象，探讨垂黄清脉冲剂干预治疗冠心病稳定型心绞痛热毒痰瘀证患者的临床疗效及对NF-κB信号通路的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本试验选取2017 年12 月-2019 年1 月就诊于宁夏医科大学总医院心内科和中医科门诊及住院部临床确诊为冠心病稳定型心绞痛，中医辨证为热毒痰瘀证型的患者为受试者，并随机分为对照组和试验组，共纳入98 例，脱落4 例，最终纳入94 例。其中男性50例，女性44 例，男性占总病例数的53.19%，女性占总病例数的46.81%，对照组男性25 例，女性23 例，年龄40-80 岁，平均年龄65.44 ± 11.65 岁；试验组男性25例、女性21 例，年龄43-80 岁，平均年龄62.53 ± 10.00岁。94 例患者中合并高血压人数者最多，其次是2 型糖尿病、高脂血症、脑梗死。对两组患者的性别、年龄、合并症分布分别经χ2检验和独立样本t 检验，差异均无统计学差异（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入、排除及诊断标准

西医诊断标准参照《内科学》第8 版，人民卫生出版社，“冠心病—稳定型心绞痛”诊断标准[8]。中医诊断标准参照《中医内科学》第2 版，人民卫生出版社，“胸痹心痛”诊断标准和《中药新药临床研究指导原则》2002年版，中国医药科技出版社，相关诊断标准[9]。中医辨证标准参考王琼[10]、李景君[11]等对胸痹心痛—热毒痰瘀证型拟定的主症和次症诊断标准。纳入标准、排除标准、病例剔除和脱落标准、中止试验标准等详见本课题前期已发表的临床疗效观察研究方案[12]。

1.3 治疗方案

本试验采用中西医结合治疗方案。在受试前和受试期间，两组患者均给予低盐低胆固醇饮食，对有合并症者均给予对症治疗。常规西药治疗药物：阿托伐他汀钙片20 mg，每晚一次，口服（批准文号：国药准字H20093819，规格：20 mg×7 片，北京嘉林药业股份有限公司）。阿司匹林肠溶片100 mg，每日1 次，口服（批准文号：国药准字H20153035，规格：100 mg × 45片，石药集团）。将服用常规西药+银丹心脑通软胶囊设为对照组，银丹心脑通软胶囊主要成分：银杏叶、丹参、灯盏细辛、绞股蓝、山楂、大蒜、三七、艾片。用法用量：口服，一次2-4 粒，一日3 次。（批准文号：国药准字Z20027144，规格：0.4 g × 12 粒× 3 板，贵州百灵企业集团制药股份有限公司制造）。服用常规西药+垂黄清脉冲剂设为试验组，垂黄清脉冲剂药物组成：垂盆草（生产批号：1801002C）、大黄（生产批号：1804001W）、昆布（生产批号：1802001H）、牡蛎（生产批号：1809001W）、蒲黄（生产批号：1804001S）、茯苓（生产批号：1805001C）等。免煎配方颗粒剂单味小包装药物采用单味中药有效成分提取物煎煮、浓缩制备，由华润三九医药股份有限公司提供。服法：热水200-300 ml冲服，每日1剂，早晚分服。所有受试者均连续服药，1个疗程时长为4周，共3个疗程。

1.4 观察指标与检测方法

多层螺旋CT 对冠状动脉狭窄程度的诊断具有较高的准确性。根据美国心脏病协会所规定的冠状动脉血管图像记分分段评价标准，评定每支冠状血管病变狭窄程度采用Gensini 评分法[13]，因此对所有受试者治疗前后行冠状动脉CT 检查，并将Gensini 积分作为疗效观察指标之一。由至少2位中级以上职称医师行冠状动脉CT 检查操作，共同评估患者病变部位、性质、狭窄程度，并出具检查报告单，由试验研究人员当场计算Gensini评分。

血清样本收集：所有受试者均在入院次日和疗程满后次日清晨各取空腹肘静脉血3 ml。使用EDTA 柠檬酸盐抗凝管进行收集，并离心处理。转速3000 r·min-1，时间：10 min；分离血清后冻存于-80℃冰箱中待测。

血清炎性因子测定：采用酶联免疫吸附测定法（Elisa 法）检测两组受试者用药前后血清中肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）、核转录因子-κB（Nuclear factor-κB，NF-κB）、白 介 素-6（Interleukin-6，IL-6）、血 管 细 胞 粘 附 分 子-1（VCHDcular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、细胞间 粘 附 分 子-1（Intercellular adhesion molecule-1，VCAM-1）、白介素-1（Endothelin-1，ET-1）、一氧化氮（Nitric oxide，NO）的浓度水平。

1.5 疗效判定标准

临床疗效的判定参照2002年卫生部颁布的《中药新药临床研究指导原则》[14]。总有效率=（显效+ 有效）/总例数（n）×100%。

1.6 统计学方法

统计方法采用SPSS22.0 对试验数据进行统计分析，数据录入及统计分析过程中试验知晓人员不得参与，以免数据产生人为偏倚。计量资料以xˉ±S进行统计描述，符合正态分布及方差齐性采用t检验，组间均数比较采用独立样本t 检验，治疗前后比较采用配对样本t检验；不符合正态分布时采用非参数检验或秩和检验。检验水准α=0.05，以P ＜0.05认为差异有统计学意义，以P＜0.01认为有统计学显著性差异。

表1 Gensini积分对比（Xˉ± S）

表2 临床疗效比较（n，%）

1.7 伦理学审查

本试验研究已通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会的批准。

2 研究结果

2.1 冠状动脉狭窄程度比较

将两组患者冠状动脉狭窄程度的Gensini 积分进行对比。与本组治疗前比较，两组患者治疗后冠状动脉狭窄程度均明显改善（P＜0.05，P＜0.01）。与对照组比较，试验组冠状动脉狭窄程度明显降低（P＜0.05），详见表1。

2.2 临床疗效比较

试验组患者的总有效率明显高于对照组（P＜0.05），详见表2。

2.3 两组患者治疗前实验室指标浓度比较

将两组患者治疗前实验室指标进行对比，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性，详见表3。

2.4 炎性因子浓度水平比较

对两组患者每组治疗前、后血清中TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 浓度水平均进行配对样本t检验，均有统计学显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。与治疗前比较，两组患者治疗后血清中TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 浓度水平均明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与对照组比较，试验组患者治疗后降低更显著（P＜0.01）。

表3 治疗前实验室指标浓度比较（Xˉ± S）

对两组患者治疗后血清中炎性因子TNF-α、NFκB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 浓度水平进行独立样本t检验。与对照组比较，试验组TNF-α、NF-κB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1浓度水平降低更明显（P＜0.05），详见表4中各组t值。

2.5 血管内皮功能评价指标比较

对两组患者每组治疗前、后血清中NO、ET-1浓度水平均进行配对样本t检验，均有统计学显著性差异（P＜0.05，P＜0.01）。与治疗前比较，两组患者治疗后血清中NO 浓度水平均明显升高，ET-1 浓度水平明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与对照组比较，试验组患者治疗后NO 浓度水平升高、ET-1 浓度水平降低趋势更为显著（P＜0.01）。

对两组患者治疗后血清中内皮功能评价指标NO、ET-1 浓度水平进行独立样本t检验，与对照组比较，试验组NO 浓度水平升高、ET-1 浓度水平降低更明显（P＜0.05），详见表5中各组t值。

2.6 安全性评价

94 例患者在为期3 个疗程的治疗过程中，治疗前后患者的各项安全指标（血常规、尿常规、粪便常规+隐血试验、肝肾功能等检查）均未见与治疗药物相关的明显异常差异。

表5 治疗前后血管内皮功能评价指标水平对比（Xˉ± S）

3 讨论

3.1 垂黄清脉冲剂对NF-κB信号通路的影响

动脉粥样硬化的形成机制涉及到多种细胞及细胞因子、粘附分子、生长因子等多个因素[15-16]。其中NF-κB 信号通路对AS 发生和发展的影响是多方面的，不仅参与了炎症反应，还对血管内皮细胞损伤、平滑肌细胞增殖迁移、氧化应激进行调控、诱导血管细胞凋亡等，是调控转录多种因子的中心环节和共同通路。

当血管内皮细胞受损引发炎症反应时，促使多种炎性细胞聚集并迁移至损伤部位。他们被激活后导致TNF-α的生成与释放增加。TNF-α作为NF-κB 信号通路的上游元件及早期启动因子引发炎症反应，并维续炎症扩大和级联，加速AS 的发生发展[17]。TNF-α大量释放后诱导NF-κB 信号通路的下游元件中白介素（主要为IL-1 和IL-6）的生成和ICAM-1、VCAM-1过度表达，并刺激多种细胞产生炎症因子和趋化因子。其中IL-6在NF-κB信号通路中扮演着多种角色，可通过对肝脏肝细胞的刺激来生成C 反应蛋白（Creactionprotein，CRP）等急性反应蛋白，被作为炎症反应的一个标志物来反映炎症的程度。由VCAM-1 和ICAM-1 介导的单核细胞与血管内皮细胞间黏附是冠心病发生的重要环节，也是出现在动脉粥样硬化形成过程中最早的现象之一[18]。这些因子基因的启动子和增强子与NF-κB 中对应的一个或多个κB 序列相结合，从而使NF-κB被激活。激活后的NF-κB又是这些因子的活化剂，使IL-6、TNF-α、VCAM-1 和ICAM-1基因被活化，增强其转录功能，使这些因子的产生和释放增多。而NF-κB 在激活这些炎性因子的同时，它们又成了NF-κB 通路的激活剂，刺激NF-κB 过表达，以恶性循环的方式加剧炎症反应，甚至出现炎症反应失控。只有当NF-κB 被激活并导致这些炎症相关因子过度表达，才会引起明显的炎症反应[19]。在这一过程中炎性因子IL-6、TNF-α、VCAM-1 和ICAM-1 和释放出来的相关细胞因子形成正负反馈环激活NF-κB,引起细胞因子不断上调和炎症持续，参与动脉粥样硬化的发生、发展[20-21]。Collins 和Cybulsky 在研究中发现[22]，NF-κB 表达的区域很可能最终衍化为动脉粥样硬化斑块，而缺乏NF-κB 表达的部位形成粥样斑块可能性则较小。

表4 治疗前后炎性因子水平对比（Xˉ± S）

本课题从“邪毒”理论出发，结合现代对冠心病发病机制的研究，探讨中药新配方垂黄清脉冲剂对冠心病治疗作用机制。以前期已经完成的冠状动脉粥样硬化模型动物实验及体外实验[23-24]表明中药新配方垂黄清脉冲剂及其拆方可上调I-κBmRNA 的表达和下调NF-κBmRNA 的表达而发挥抗主动脉粥样硬化闭塞症的作用；含药血清可对体外因TNF-α高表达引起的血管内皮损伤起到一定程度的保护作用，减轻TNF-α对内皮细胞器的破坏，且高浓度含药血清对内皮细胞的保护作用更明显，推测其作用靶点可能与抑制TNF-α的表达有关。本课题前期已经完成对垂黄清脉冲剂的临床疗效观察试验，结果表明垂黄清脉冲剂可使冠心病稳定型心绞痛热毒痰瘀证患者的血脂水平显著降低，使血清同型半胱氨酸浓度下降，同时抑制了脂质代谢和炎症反应的表达；明显缩小患者动脉粥样硬化斑块，降低冠状动脉狭窄程度；改善了患者临床症状。

本次试验结果显示，治疗前两组患者的血清中TNF-α、NF-κB、IL-6、ICAM-1、VCAM-1 浓度水平均出现高表达，治疗后浓度水平则呈现显著降低趋势，其中试验组降低程度尤为明显。因此，可以推测垂黄清脉冲剂能有效抑制血管内皮细胞进入活化状态，抑制血管内皮与炎症细胞间、多种炎症细胞间以及炎症细胞与细胞外基质间的粘附作用，从而降低炎症和免疫反应，减缓动脉粥样硬化的发生，其机制可能与垂黄清脉冲剂能够作用于NF-κB 信号通路，下调血清中NF-κB 信号通路上游元件TNF-α的表达水平，减少其对NF-κB的激活，同时下调NF-κB信号通路下游元件IL-6、ICAM-1、VCAM-1的表达水平，阻止炎症反应发生级联效应有关。

3.2 垂黄清脉冲剂对血管内皮功能的影响

在冠心病发病过程中，血管内皮功能发挥着重要作用。研究发现[25]血管内皮功能受损可能是心血管病变发生的开始和核心环节。内皮损伤会导致动脉弹性降低，引发粥样硬化改变。对血管内皮功能的评估是预测冠心病患者未来心血管事件发生的一项独立指标，血管的舒张收缩依赖于血管内皮结构的完整性，因此可以把ET-1/NO 比值作为内皮功能的一项重要评价指标。

近年来研究发现血管舒张因子NO 和血管收缩因子ET-1 的动态平衡变化在调节血管壁收缩，维持微环境稳态方面起到了重要的作用[26]。生理状态下，内皮细胞同时释放NO 舒张血管，ET-1 收缩血管，两者协调平衡，共同维持着血管内皮功能。病理状态下，NO合成和释放减少，ET-1生成增加，两个指标的比例平衡被打破，血管顺应性降低，加速了内皮功能的损伤，促进了动脉粥样硬化的形成。Velasco 等[27]认为动脉粥样硬化时，ET-1的增高和NO分泌减少，使得ET-1/NO 比值的动态平衡失调，这种失调也可能是导致ET-1 分泌增多的原因之一，而ET-1 分泌过多使得血管收缩过度，又加重了内皮功能的损伤。

本研究结果显示，治疗前两组患者的血清ET-1水平均出现高表达，NO 水平均出现低表达，且ET-1升高、NO 降低水平与冠状动脉管腔狭窄程度密切相关。治疗后两组患者血清ET-1 水平均显著降低，NO水平则均升高，尤以垂黄清脉冲剂组ET-1 水平降低、NO 水平升高趋势更明显。因此，可以推测垂黄清脉冲剂能有效抑制血管平滑肌细胞收缩和增殖，扩张血管，保护血管内皮功能，其机制可能与下调血清中ET-1 表达水平、上 调NO 水平，减小ET-1/NO 比值有关。

由于时间及条件的限制，本课题采用了单盲、随机、对照临床观察的研究方法，目前还无法做到对患者未来病情发展情况进行追踪。希望在后续的研究中可以更好的做到双盲或双盲双模拟以及对患者远期病情进行追踪观察。