不同激素对乌腺金丝桃愈伤组织诱导与增殖的影响

于风驰,李自强,李昊阳,王铎森,刘晓丹

(吉林农业科技学院，吉林 吉林 132101)

1 引言

金丝桃属(HypericumL.)中特有的活性成分金丝桃素，具有明显的抗病毒、抗抑郁作用，同时可增强免疫力[1]；其中药制剂也可作为兽药。长白山地区具有丰富的野生金丝桃资源，主要是长柱金丝桃、短柱金丝桃和乌腺金丝桃，其中乌腺金丝桃在吉林省具有广泛的分布。

利用植物细胞培养技术大规模生产具有重要经济价值的天然活性成分为中草药的可持续发展提供了一条新的途径。多年来，对金丝桃素的需求持续攀升，国内外有关金丝桃属离体培养的研究也随之大幅增加[1,2]。

本研究以金丝桃素含量较高的乌腺金丝桃为试材，探讨不同激素配比对乌腺金丝桃愈伤组织诱导与增殖的影响，最终建立乌腺金丝桃愈伤组织诱导和增殖培养体系。可为将来乌腺金丝桃悬浮细胞培养体系的建立提供优质的细胞资源。

2 材料与方法

2.1 试验材料

植物材料：乌腺金丝桃无菌苗。

主要试剂：MS培养基(青岛海博)，2,4-D、6-BA 及KT等激素(上海绿叶)。

2.2 方法

2.2.1 外植体的获得

在超净工作台中，将乌腺金丝桃无菌苗幼嫩的叶片进行切割，由于无菌苗较小，切割时可以带有部分茎段，长度约1 cm备用。

2.2.2 愈伤组织的诱导

借鉴已报道的文献[3,4]，采用4种愈伤诱导培养基激素组合：1号：2,4-D 0.6 mg/L+ KT 0.4 mg/L；2号：2,4-D 0.6 mg/L+6-BA 0.4 mg/L；3号：2,4-D 1.2 mg/L+ KT0.2 mg/L；4号：2,4-D1.2 mg/L+6-BA 0.2 mg/L。将上步准备的外植体接种到1～4号培养基中，每瓶接种10个左右材料，每种培养基接种10瓶，(25±1)℃，避光培养 15 d后，统计诱导率，确定最佳的激素配比。诱导率=(愈伤总数/外植体总数)×100%。

2.2.3 愈伤组织的增殖

考虑不同分裂素的激活作用不同，设计6种增殖培养基激素组合：5号：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.2 mg/L；6号：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.2 mg/L；7号：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.4 mg/L；8号：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L；9号：2,4-D 0.6 mg/L+KT0.6 mg/L；10号：2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.6 mg/L。将上步形成的愈伤切割成0.5 cm2的小块，接种到5～10号培养基中，每个培养瓶中接种5块，每种培养基接种10瓶，每15 d转接一次。接种 6周后，统计增殖率。分析不同激素配比对愈伤增殖的影响，确定乌腺金丝桃愈伤的增殖最适培养基配方。增殖倍数=转瓶后愈伤鲜重/转瓶前愈伤鲜重。

3 结果与分析

3.1 不同激素组合对乌腺金丝桃愈伤组织的影响

将乌腺金丝桃无菌苗的叶片接种到不同愈伤组织诱导培养基中，(25±1)℃，培养 15 d 后统计愈伤组织诱导率，结果见表1。

表1 不同激素对愈伤组织诱导的影响

当2,4-D浓度水平一致时时，细胞分裂素KT对愈伤组织的诱导率明显好于6-BA。而对比不同浓度生长素2,4-D对诱导率的影响，发现浓度为0.6 mg/L时形成的愈伤组织质地疏松且生长快，仅有少量褐化，更适合乌腺金丝桃愈伤组织的诱导(图1)，其中1号培养基中愈伤组织诱导率最高，最终确定最佳激素配比即为2,4-D 0.6mg/L +KT 0.4 mg/L。

图1 乌腺金丝桃愈伤组织诱导结果

3.2 不同激素组合对乌腺金丝桃愈伤组织增殖的影响

在不同增殖培养基中，培养60 d后，统计结果如表2。激素组合为2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L时，愈伤组织的增殖倍数最高，达7.2。在2,4-D浓度相同的条件下，两种细胞分裂素的浓度由0.2 mg/L增加至0.4 mg/L时，增殖倍数均明显增大；对比相同浓度水平下KT与TDZ对增殖倍数的影响，TDZ的效果更好。当两种细胞分裂素的浓度均提高到0.6 mg/L时，愈伤组织的增殖率反而下降。最终确定8号培养基为最佳激素组合，即2,4-D 0.6 mg/L+TDZ0.4 mg/L。

表2 不同激素比对愈伤组织增殖的影响

4 讨论

外源激素的种类与浓度对不同植物愈伤组织的诱导与增殖中发挥关键作用。作金丝桃属植物愈伤的诱导和增殖中，激素的组合和配比差异显著。李景原2000年对贯叶金丝桃细胞培养中发现，当激素配比为2,4-D1 mg/L+NAA1 mg/L时愈伤组织的诱导率高达92.86%[5]；而许明淑2001年对贯叶金丝桃研究结果表明，激素配比为2,4-D2.0 mg/+6-BA2.0 mg/L时诱导形成愈伤组织最多[6]；张娜在2005年对贯叶连翘进行愈伤组织诱导时发现，培养基为MS+2,4-D 0.2 mg/L+KT0.02 mg/L时，效果最好[7]。于晓坤2012年在贯叶连翘愈伤组织培养时发现，KT 浓度为0.02 mg/L时适宜增殖[8]。

本试验以金丝桃素含量较高的乌腺金丝桃为材料，成功建立其愈伤组织培养体系；以此为出发材料，目前项目组正在进行悬浮细胞培养体系研究，以期为工业化大规模合成并生产金丝桃素提供理论参考。