高效液相色谱法测定化妆品中水杨酸含量的不确定度评定

李静静，范菲，朱清

（西安市食品药品检验所，西安 710054）

水杨酸最早是从柳树皮中分离出的一种活性成分，后被证实是植物体内广泛存在的一种天然酚类化合物，对一些重要的代谢过程起调控作用，所以被看作为一种植物激素［1］。水杨酸除具有防腐杀菌作用外，还有止痛消炎，角质剥脱，促进皮肤新陈代谢的功能，被广泛应用于化妆品行业，存在于各种去屑、美白和祛痘类化妆品中［2-3］。但水杨酸的角质层剥脱功能在去角质同时也具有腐蚀作用，易刺激皮肤、黏膜，过量使用会使皮肤的防御力变差［4-5］。因此不适宜长期使用，尤其不适用于儿童。

《化妆品安全技术规范》（2015 年版）［6］中采用高效液相色谱法对化妆品中的水杨酸进行测定，并且明确规定了水杨酸在驻留类产品和淋洗类皮肤用产品中最大许可用量为2.0%，在淋洗类发用产品中最大许可用量为3.0%，但是在化妆品中作为防腐剂使用时，最大许可用量为0.5%，并注明除香波外，不得用于三岁以下儿童使用的产品中。《化妆品安全技术规范》（2015 版）对水杨酸的限量要求与旧版（2007 版）相同，但不同于旧版中将水杨酸作为去屑剂组分和其它组份共同测定。2015 年版首次增加了单独针对化妆品中水杨酸含量的专属检测方法，反映了我国对于化妆品质量安全性保障、技术标准的专属性和可操作性等在进一步提高，加强了市场监管力度。

测量不确定度是对测量结果准确度的定量表征，测量结果的可用性很大程度上取决于不确定度的大小［7］。考虑到测量过程中影响因素复杂，测定结果必然会带有一定的不确定性，会导致评判依据可信度降低。所以测量结果附有不确定度说明才是完整并有意义的。近年来，各类检验检测机构都开展了大量的不确定度评定工作［8-12］，以此提升实验结果的可信度和可用性。笔者参照《化妆品安全技术规范》（2015 年版），用高效液相色谱法对化妆品中水杨酸的含量进行了测定，根据新版JJF 1059.1—2012 《测量不确定度评定与表示》［13］，建立数学模型，对这一实验过程的各项影响因素进行了不确定度评估，为评定测量结果提供科学依据。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

液相色谱仪：ULTIMATE 3000 型，配DAD 检测器，美国赛默飞世尔科技有限公司；

电子天平：MS105 型，d=0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司；

电子天平：BSA124S-CW，感量为0.1 mg，德国赛多利斯公司；

水杨酸标准品：99.9%，中国药品生物制品检定所；

甲醇、磷酸、氨水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

磷酸溶液：称取11.5 g 磷酸，加入950 mL 水，用氨水调节至pH2.3～2.5，加水至1 000 mL；

实验用具为计量检定合格的A 级玻璃量器；

实验用水为Milli-Q 自制超纯水。

1.2 色谱条件

色谱柱：C8（250 mm×4.6 mm，5 μm，日本SHISEIDO CAPCELL PAK）；检测波长：300 nm；柱温：30℃；流动相A：量取200 mL 磷酸溶液，并用水稀释至1 000 mL；流动相B：量取250 mL 磷酸溶液，并用甲醇稀释至1 000 mL；流量1.2 mL／min；梯度洗脱程序见表1。

1.3 实验环境条件

温度为(20±5)℃，相对湿度不大于75%。

表1 梯度洗脱程序

1.4 水杨酸系列标准溶液的制备

称取水杨酸对照品50 mg 置于50 mL 容量瓶，用甲醇溶解并定容，作为标准储备液。再分别精密量取1，2，5，10，20 mL 标准储备液，置于100 mL 量瓶中，用甲醇定容后作为水杨酸系列标准溶液。

1.5 样品处理

称取样品约0.25 g，置25 mL 具塞比色管中，加入甲醇20 mL，旋涡60 s，分散均匀，超声提取15 min，冷却至室温后，用甲醇定容至标线，涡旋振荡摇匀后，用0.45 μm 有机滤膜过滤后，作为待测溶液。

2 数学模型及测量不确定度的来源

2.1 数学模型

样品中水杨酸含量按照式(1)计算：

式中：w——化妆品中水杨酸的质量分数，%；

D——稀释倍数（不稀释则为1）；

ρ——从标准曲线得到的水杨酸质量浓度，μg／mL；

V——样品定容体积，mL；

m——样品取样量，g。

样品测定结果的不确定度除上述计算公式中的ρ，V和m的影响外，重复测定样品时的均匀性和一致性也会对测定结果产生影响。

2.2 测量不确定度的来源

由式(1)分析，不确定度的来源如下。

（1）标准物质引入的不确定度：包括标准物质纯度u(w)、标准物质称重u(m1)、玻璃量瓶u(V1)、玻璃移液管u(V2)、由标准曲线引入的不确定 度u(C)；

（2）被测样品引入的不确定度：包括样品称重u(m2)、定容u(V3)、样品平行测定重复性引入的不确定度u(f)；

（3）测量时液相色谱仪引入的不确定度u(r)。

式(1)中各分量相互独立，合成相对标准不确定度按照式(2)计算。

3 测量不确定度评定

3.1 标准物质引入的相对标准不确定度

3.1.1 纯度引入的相对标准不确定度urel(w)

水杨酸标准物质说明书标识其纯度为99.9%，但未给出其纯度误差范围，假定其分布区间为±0.1%，其区间半宽度为0.1%，按均匀分布（矩形分布）考虑，包含因子3k=，则标准物质纯度引入的相对标准不确定度：

3.1.2 天平称重引入的相对标准不确定度urel(m1)

标准物质称量所用天平的精度为十万分之一，其不确定度来源主要考虑两项：示值误差u(m1a)、重复性误差u(m1b)。

校准证书给出的重复性误差为0.15 mg，其区间半峰宽为0.075 mg，按矩形分布计算（3k=），则重复性引入的不确定度：

由以上两项合成得到标准不确定度：

实际称取水杨酸标准物质为49.94 mg，其纯度为99.9%，则天平称量引入的相对标准不确定度：

3.1.3 容量瓶引入的相对标准不确定度urel(V1)

容量瓶引入的不确定度分量包括容量允差u(V1a)，和实验温度与校正温度差异引入的不确定度u(V1b)。

容量允差引入的相对标准不确定度：

（2）温度校正引入的不确定度u(V1b)。已知实验环境温度为25℃，容量瓶校准温度为20℃，甲醇和玻璃的膨胀系数分别为1.2×10-3，2.5×10-4℃-1，按照均匀分布，包含因子3k=，温度差异引入的不确定度：

u(V1b-1)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×50×(25-20)／k=0.14 (mL)

u(V1b-2)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×100×(25-20)／k=0.27 (mL)

温度校正引入的相对标准不确定度：

容量瓶引入的相对标准不确定度：

3.1.4 移液管引入的相对标准不确定度urel(V2)

同理，移液管引入的不确定度分量包括容量允差、实验温度与校正温度差异带来的影响，数据列于表2。

表2 移液管引入的不确定度

移液管引入的相对标准不确定度：

3.1.5 标准曲线拟合引入的相对标准不确定度urel(C)

采用最小二乘法，以浓度C为横坐标，平均峰面积A为纵坐标，进行线性拟合，结果列于表3。

表3 水杨酸标准溶液校准结果

由表3 得到标准曲线为A=26.126 6C+5.385 5，其中，相关系数r2=1.000 0，斜率a=26.126 6，截距b=5.385 5。

按照式(3)计算标准溶液峰面积的标准偏差：

式中：n——标准溶液测定次数，n=10；

a——线性回归方程斜率；

b——线性回归方程截距。

将上述各值代入式(3)，计算得s(A)=5.701 1。

按照式(4)计算由工作曲线变动引起浓度C的标准不确定度u(C)：

式中：s(A)——标准溶液峰面积的标准偏差：

N——样品平行测定次数，N=4；

C——被测样品溶液中水杨酸的质量浓度，18.73 μg／mL；

C——标准系列溶液的平均质量浓度，75.83 μg／mL；

将上述各值代入式(4)，计算得u(C)=0.152 1，则标准曲线引入的相对标准不确定度：

3.2 被测样品引入的相对标准不确定度

3.2.1 样品称重引入的相对标准不确定度urel(m2)

合成得样品称量引入的标准不确定度：

已知样品称取两份，分别为0.261 3 g，0.265 0 g，则样品称量引入的相对标准不确定度：

3.2.2 比色管引入的相对标准不确定度urel(V3)

（2）温度校正引入的不确定度。已知实验环境温度为25℃，比色管校准温度为20℃，甲醇和玻璃的膨胀系数分别为1.2×10-3和2.5×10-4℃-1，按照矩形分布（3k=），温度校正引入的不确定度：

u(V3b)=(1.2×10-3-2.5×10-4)×10×(25-20)／k=0.027 (mL)

比色管引入的相对标准不确定度：

3.2.3 重复性测定引入的相对标准不确定度urel(f)

该不确定度为A 类评定，在实际测量样品时，对2 份样品各测定2 次（n=4），含量分别为18.44，18.50，18.98，18.99 μg／mL，实际测量中以平均值18.73 μg／mL 作为测量结果。

重复性测定引入的相对标准不确定度为：

3.3 液相色谱仪引入的相对标准不确定度urel(r)

由校准证书上可知，高效液相色谱仪的定量重复性为0.21%，则其相对扩展不确定度为0.21%。按分布计算，包含因子3k=，则液相色谱仪引入的的相对标准不确定度：

3.4 相对合成标准不确定度

测量不确定度各分量的分析结果见表4。

表4 各分量相对标准不确定度汇总

根据式(2)计算合成相对标准不确定度：

3.5 相对标准扩展不确定度

根据公式(1)和两次独立测定结果计算得到2 份化妆品样品中水杨酸的含量为0.177%和0.179%，平均值为0.178%。因此其平均含量的相对标准不确定度：

取置信概率为95%，包含因子k=2。则相对标准扩展不确定度：

3.6 标准扩展不确定度

化妆品中水杨酸含量的标准扩展不确定度为：

3.7 不确定度报告

化妆品中水杨酸含量为0.178%±0.004%，k=2。

4 结语

高效液相色谱法测定水杨酸含量不确定度的主要影响来源于标准曲线拟合、样品重复测定、玻璃量器的使用，以及样品和标准品称重等。工作曲线各校准点浓度均值应尽量与被测样品浓度均值C接近，可降低标准曲线变动引入的不确定度。在称量样品时，两份样品的称量值应当尽量接近，可降低样品重复测定引入的不确定度。在使用玻璃量器时，尽量使用校正级别高的量器，并且控制实验室温度与量器校准时温度接近，可降低玻璃量器引入的不确定度。在样品和标准品称重时，在可操作范围内尽量加大取样量，可降低由称重引入的不确定度。