小麦秸秆还田量对土壤Cd有效性及水稻Cd亚细胞分布的影响

2020-07-31黄界颍武修远佟影影杨卉艳

农业环境科学学报 2020年7期

黄界颍，武修远，佟影影，曹森，高越，杨卉艳

我国农业用地重金属污染严重。据报道，我国11 个省市25 个地区存在土壤Cd 污染问题，总面积达1.3 万km2[1]，且在2005 年到2017 年间，Cd 含量较背景值有所升高[2]。一般认为，水稻是对Cd吸收能力最强的大宗谷类作物[3]。在研究作物对Cd 迁移转化过程中，亚细胞分级技术已经成为评价植物对Cd 积累过程的重要方法，研究表明，作物籽粒的Cd含量受细胞壁吸附和液泡截留的影响显著[4-5]。同时相关研究[6]指出植物通过细胞壁固定和液泡区室化可以避免Cd进入细胞器，从而减轻Cd 对细胞器及膜结构的破坏[7]，避免了Cd 对细胞正常代谢的毒害。因此，通过不同部位水稻Cd 的亚细胞分析，有助于系统评价土壤-水稻系统中Cd 的有效性。国内评价土壤重金属的有效性，常用中性盐和有机络合物作为一次提取剂[8-9]，但近期研究表明，梯度扩散薄膜技术（Diffusive gradients in thin-films，DGT）[10]相较于常规的一次提取剂，通过模拟金属离子在土壤体系的扩散与固-液交换过程，更真实地反映Cd 的有效性及Cd 的转运情况。因此，DGT 被认为是一种预测植物吸收Cd 的较好方法[11-12]。

我国是秸秆大国，秸秆作为重要的有机物资源被广泛应用于土壤改良，直接还田的比例达到35%以上[13]。前期研究表明，秸秆还田缓解了Cd 对水稻的毒害[14]，这种解毒效应可能与秸秆还田引起的可溶性有机物与Cd 结合，从而降低土壤有效Cd 含量有关[15-17]，但以往的研究多以秸秆粉末还田，与生产实际情况不符，且秸秆还田对Cd的解毒机理仍不明确。因此，研究小麦秸秆还田量对Cd 在水稻体内的亚细胞分布特征影响，有助于理解秸秆还田下水稻对Cd的耐受机制。

本研究以安徽典型矿区Cd 污染土壤为对象，以实际生产中秸秆产量为还田依据，按照大田秸秆处理方式将秸秆处理成段还田，更真实地反映了田间实际情况。通过研究小麦秸秆还田量对水稻Cd亚细胞分布的影响，从器官和亚细胞水平上探讨秸秆还田下水稻对Cd 的耐受解毒机制，同时运用3 种典型的土壤重金属有效态评价手段，对土壤-水稻系统中Cd运移情况进行评估对比，以期为Cd 污染农田的秸秆还田提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试土壤

供试土壤采集于安徽某矿区（30°56′39″N，117°59′16″E），土壤类型为水稻土，土壤全Cd含量超过现行《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准（试行）》（GB 15618—2018）中农用地土壤污染风险管控值2倍以上，达重度污染，其基本理化性质见表1。

表1 供试土壤基本理化性质Table 1 The physico-chemical properties of the tested soil

1.1.2 供试秸秆

供试秸秆为小麦秸秆，品种为烟农19 号。小麦秸秆经风干后剪至3～5 cm备用。

1.1.3 供试作物供试作物为水稻，品种为丰两优香1，由安徽农业大学农学院水稻课题组提供。

1.1.4 其他材料

梯度扩散薄膜装置购自南京智感环境科技有限公司。

1.2 试验设计

秸秆还田土壤处理采用盆栽试验，该水稻盆栽试验在安徽农业大学农萃园开展。试验设常规施肥无秸秆对照（CK）、半量小麦秸秆还田（Half dose wheat straw，HDWS）、全量小麦秸秆还田（Full dose wheat straw，FDWS）3 个处理，每处理重复12 次。以安徽平均小麦秸秆产量计算得每盆钵中小麦全量、半量秸秆量分别为10.6 g和5.3 g[18]。将过2 mm 筛的重度Cd污染土样装入上口径28 cm、下口径20 cm，高30 cm 的塑料盆钵中，按照3 个小麦秸秆还田水平混匀，用（NH4）2SO4、KH2PO4、K2SO4溶液施基肥，加入量分别为N：0.10 g·kg-1，K2O：0.10 g·kg-1，P2O5：0.07 g·kg-1。淹水培养15 d 后于2019 年5 月15 日移栽30 d 秧龄幼苗，每钵定苗4 株，其他措施按照当地优质栽培管理措施进行。水稻于2019 年9 月30 日收获，全生育期169 d。分别在水稻苗期、分蘖期、灌浆期和成熟期各取3 盆采集全株植株，用于植株不同部位及各亚细胞组分Cd含量的测试。同期，取盆栽土样，除去植物根系，风干后分别过2 mm 筛，用于土壤有效态Cd 含量测定。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 土壤Cd有效态测定

土壤有效态Cd 分别采用CaCl2（0.01 mol·L-1）、EDTA（0.005 mol·L-1）和DGT 3 种具有代表性的提取剂浸提。DGT测定方法如下[19]：

采用梯度扩散薄膜技术测定土壤Cd有效态。将研磨过筛后的土样调节最大田间持水量80%，土壤平衡48 h后放置于DGT并暴露24 h。回收固定膜，使用1 mol·L-1硝酸提取待测。

DGT浓度（CDGT）计算方法如下：

式中：M为固定膜中Cd 的积累量，µg；Ce为提取液Cd浓度，µg·L-1；Ve为提取液体积，L；Vg为固定相体积，L；fe为Cd提取率。

利用公式（2）计算DGT浓度：

式中：Δg为扩散层厚度，cm；D为磷酸根离子在DGT扩散层中的扩散系数，cm2·s-1；A为每一个圆片膜的面积，3.14 cm2；t为DGT装置的放置时间，s。

1.3.2 植物及其亚细胞组分Cd含量测定

亚细胞分组方法[20]如下：采集新鲜水稻样，经清洗剪切处理后，在低温环境下使用液氮研磨至粉末状。以与样品1∶5 的比例加入提取剂，提取剂成分为250 mmol·L-1蔗糖、50 mmol·L-1tris-HCl、1.0 mmol·L-1二硫赤藓糖醇、5.0 mmol·L-1抗坏血酸、1.0%Polyclar AT PVPP（pH=7.5）。

采用分级离心法分离细胞不同组分：将上述混合样品7 000 r·min-1离心20 min，沉淀为细胞壁组分（F1）；再将上一步骤中得到的上清液12 000 r·min-1离心40 min，得到的上清液即为细胞可溶性组分（F3），沉淀为细胞器组分（F2），采用硝酸-高氯酸消解（GB 5009.15—2014）待测。

利用ZEEnit-700P 原子吸收分光光度计和ICAP6000Series 电感耦合等离子发射光谱仪测定Cd浓度，测定过程中使用国家标准物质（GBW07405、GBW07460）进行质量控制。

1.4 数据处理

采用Excel 2016、Origin 2017 对试验数据处理分析和常规作图，采用SPSS 25.0 进行相关性分析和差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 小麦秸秆还田量对水稻Cd亚细胞分布的影响

2.1.1 小麦秸秆还田量对水稻根Cd亚细胞分布的影响图1 为小麦秸秆还田量对各生育期水稻根Cd 亚细胞分布及含量分配的影响。整体上，小麦秸秆还田降低了水稻苗期与分蘖期根部F1、F2和F3中的Cd含量，但提高了灌浆期和成熟期根部F1、F2 和F3 中的Cd 含量；在根部各亚细胞组分的Cd 含量分配上，不同生育阶段不同处理均呈现F1＞F3＞F2，至生育后期各处理F2和F3组分中的Cd含量百分比上升，但仍以F1 组分中的Cd 含量占比最大，并未表现出秸秆还田量间的一致规律（图1d）。在苗期，F1、F3 中的Cd 含量均表现为CK 高于秸秆还田组（P＜0.05），降幅达35.8%～76.0%和58.8%～69.1%，到了分蘖期CK 与秸秆还田组之间的Cd 含量差距缩小，这可能是秸秆还田在短时间内促进了土壤对Cd 的吸附，降低了植物对Cd 的吸收所致。而在灌浆期，F1 组分FDWS 的Cd含量显著大于HDWS 和CK，在成熟期F3 组分HDWS的Cd 含量显著大于CK，这种现象可能与秸秆腐解程度有关。而在F2 中，所有生育阶段中处理间均无显著性差异。

2.1.2 小麦秸秆还田量对水稻茎Cd亚细胞分布的影响小麦秸秆还田量对各生育期水稻茎Cd亚细胞分布的影响如图2 所示，小麦秸秆还田显著降低了灌浆期和成熟期水稻茎部F1、F2 中的Cd 含量，亦显著降低了分蘖期和灌浆期F3 中的Cd 含量，在茎部各亚细胞组分的Cd 含量分配上，不同生育阶段不同处理均呈现F1＞F3＞F2。在灌浆期，茎部F1、F3 中CK 的Cd含量显著高于秸秆还田组（P＜0.05）。在成熟期F2 中CK 的Cd 含量显著高于秸秆还田组，其中，FDWS 和HDWS 的F2 组分Cd 含量较CK 分别下降了45.3%和31.3%，说明小麦秸秆还田一定程度上降低了Cd对细胞器的毒害。

表2 小麦秸秆还田对不同生育期水稻各部位Cd含量的影响（mg·kg-1）Table 2 Effect of wheat stalk returning on the Cd contents of each organ in different rice varieties（mg·kg-1）

图1 小麦秸秆还田对各生育期水稻根Cd亚细胞分布及含量分配的影响Figure 1 Effects of wheat straw residue amount on Cd subcellular distribution and content in rice roots at different growth stages

2.2 小麦秸秆还田量对Cd转运系数及积累量的影响

小麦秸秆还田对不同生育期水稻各部位Cd含量的影响如表2 所示。与CK 相比，HDWS 和FDWS 在水稻分蘖期均显著降低了水稻地下部分Cd的浓度（P＜0.05），降幅达28.5%和43.5%，但是在灌浆期HDWS和FDWS 水稻地下部分Cd 的浓度显著升高，增幅达43.1%和29.2%。

小麦秸秆还田对Cd在水稻中转运系数的影响见表3。在苗期、灌浆期和成熟期，小麦秸秆还田一定程度上降低了Cd 从水稻地下部向地上部的转运能力，但效果不显著（P＜0.05）。而在分蘖期，HDWS 和FDWS 处理的转运系数较CK 有所上升，但均未达显著水平，说明在水稻的营养生长期间，小麦秸秆还田可能促进了土壤有效Cd的溶出。

小麦秸秆还田对水稻生物量的影响见表4。总体上，小麦秸秆还田处理未对水稻生物量产生显著性影响，CK 的植株地上部分生物总量要略高于HDWS和FDWS，但差异未达显著水平。

表3 小麦秸秆还田对Cd 在水稻中转运系数的影响Table 3 Effect of wheat stalk returning on the Cd transfer coefficient in rice

表4 小麦秸秆还田对成熟期水稻植株Cd积累量的影响Table 4 Effects of wheat straw residue amount on Cd accumulation in rice plants

图2 小麦秸秆还田量对各生育期水稻茎Cd亚细胞分布的影响Figure 2 Effects of wheat straw residue amount on Cd subcellular distribution and content in rice stems at different growth stages

小麦秸秆还田对水稻地上各部位Cd 积累量的影响如表4 所示。与CK 相比，HDWS 和FDWS 显著降低了水稻稻谷中Cd 积累量（P＜0.05），亦显著降低了地上部对Cd 总积累量（P＜0.05），两种处理对地上部Cd 积累量降低幅度均为0.17%，处理间未达显著水平。

2.3 小麦秸秆还田量对土壤有效态Cd的影响

小麦秸秆还田量对水稻不同生育期土壤有效态Cd 含量的影响如图3 所示。总体上，EDTA 提取剂提取的Cd 含量高于CaCl2和DGT 提取的Cd 含量，随着生育期的延长，3种提取剂提取的Cd含量均呈现增长趋势。小麦秸秆还田量对土壤有效态Cd含量的影响效应在CaCl2和EDTA 提取剂中表现不明显，仅苗期CaCl2提取的Cd 含量和EDTA 提取的Cd 含量、分蘖期EDTA提取的Cd含量表现出了与CK间的显著差异或HDWS 和FDWS 间的显著差异。其中，苗期HDWS 和FDWS 较CK 均显著降低了土壤CaCl2提取态Cd 含量（P＜0.05），下降幅度为31.1%和30.4%，且HDWS处理的EDTA 提取态Cd 含量显著低于CK 和FDWS（P＜0.05）；在分蘖期FDWS 较CK 显著提高了土壤EDTA提取态Cd 的含量，提高幅度为15.1%。而小麦秸秆还田量对土壤有效态Cd含量的影响效应在DGT提取剂中表现明显，具体表现为：在苗期，FDWS 和HDWS较CK均显著降低了DGT提取态Cd的含量，下降幅度为14.1%和43.9%。在苗期至分蘖期内，CK 增长平缓，FDWS 和HDWS 处理DGT 提取态Cd 大幅度增长，而在分蘖期后，与CK 大幅增长相反，FDWS 和HDWS增长趋于平缓，直到灌浆期，CK 中DGT 提取态Cd 的含量超过FDWS和HDWS。

图3 小麦秸秆还田对土壤有效Cd的影响Figure 3 Effect of wheat stalk returning on soil available Cd，as measured using different chemical extractants

2.4 Dose-dependent分析

2.4.1 小麦秸秆还田量变化下土壤有效态Cd 与水稻各组分Cd含量相关性分析

成熟期土壤有效态Cd 与水稻亚细胞组分Cd 含量相关性见表5。总的来说，化学提取的有效态Cd与各亚细胞组分Cd 含量相关性较差，相对而言，DGT 提取的有效态Cd 与各亚细胞组分Cd 含量相关性较好。具体表现为：DGT 提取的Cd 与茎细胞F1、F2 组分Cd 含量呈显著正相关（P＜0.05），与稻谷Cd含量极显著正相关（P＜0.01），与地下各部分CaCl2均无显著相关性；土壤CaCl2提取的Cd 与茎F2 和稻谷Cd 含量显著正相关（P＜0.05），其余部分均无明显相关性。

表5 成熟期土壤有效Cd与水稻亚细胞组分Cd含量相关性分析Table 5 Correlation analysis between soil available Cd and Cd contents in subcellular components of rice at the mature stage

2.4.2 小麦秸秆还田量变化下水稻各亚细胞组分和稻谷Cd含量相关性分析

水稻各亚细胞组分和稻谷之间的Cd含量相关性分析见表6。总体上看，大部分亚细胞组分和稻谷中Cd 含量没有相关性，只有根F3、茎F1 与茎F2 和根F3、茎F1 与稻谷间存在较好的相关性。其中，根F3组分与茎F2 显著负相关（P＜0.05），与稻谷呈极显著负相关（P＜0.01），这可能是由于根细胞可溶性组分对Cd 向稻谷转运有较强的截留作用导致。此外，茎F1与茎F2显著正相关，茎F2与稻谷显著正相关。

表6 水稻各亚细胞组分、稻谷Cd含量相关性分析Table 6 Correlation analysis between Cd contents of rice subcellular components and Cd content in rice grains

3 讨论

小麦秸秆还田对水稻Cd亚细胞分布影响差异显著。在水稻苗期与分蘖期，根系细胞壁和可溶性组分Cd 含量均表现为CK＞HDWS＞FDWS，这可能是因为Cd 在进入植物细胞之前，先于土壤中秸秆相互作用所致。秸秆还田可以通过改变土壤有机质、低分子量有机酸和pH，从而达到促进秸秆对Cd 的吸附作用[21-22]。到了灌浆期与成熟期，HDWS 和FDWS 在根系细胞壁、细胞器和可溶性组分Cd 含量高于CK，该变化可能与秸秆的腐解程度有关。相关报道[23]指出，进入农田的秸秆通常具有较快矿化速率，能固定到土壤碳库的比例较低，在历经1.5～6 个月的半衰期后，Cd 会再次释放到土壤中，从而被根系固定吸收。同时，本文结果表明，在灌浆期和成熟期，小麦秸秆还田显著降低了水稻茎细胞器组分Cd 含量，大部分的Cd被固定在了根F1 和F3、茎F1 上，从而抑制了Cd 向上转运的能力。相关研究已证明，Cd 能够对细胞器产生明显伤害，例如破坏叶绿体膜、破坏线粒体膜、损伤细胞核仁、抑制核糖核酸酶活性、改变RNA 合成[24]等。同时，孕穗期、灌浆期和成熟期是水稻籽粒Cd累积关键时期[25]。一方面，由于细胞壁富含果胶、纤维素等多糖分子，含有羟基、羧基、醛基和磷酸基等亲金属离子的配位基团[26]，易与金属离子结合，有学者提出，水稻根部的耐Cd 机制之一是将大部分Cd 累积在细胞壁上，减少Cd 向地上部的转运[27]，这种特性与细胞壁中果胶和HC1 成分含量有关[28-29]；另一方面这可能是由于秸秆中富Si 和S 的特性，研究表明，Si 能促进细胞壁对Cd 的固持[30]，S 通过促进铁斑的形成、Cd的螯合和空泡的隔离减少了水稻对Cd 的吸收和转运[31]，并能促进液泡对Cd 的区隔化[32]，由于秸秆中Si和S 的作用将大部分Cd 固定在了细胞壁和可溶性组分上，因此减少了Cd向细胞器和籽粒的运输。

小麦秸秆还田对土壤有效态Cd 影响差异显著，随着水稻根系的生长，利用DGT 技术提取的土壤有效态Cd 逐渐增大。报道指出，Cd 胁迫会刺激根系分泌有机酸，且Cd 胁迫对根系分泌氨基酸的种类影响不大，但对分泌量变化影响显著[33]。同时，根系分泌物中的柠檬酸、酒石酸等有机酸或氨基酸类物质对重金属有明显的活化作用[34]。因此，根系分泌物与土壤Cd 相互作用可能是有效态Cd 升高的主要原因。秸秆还田明显抑制了土壤有效态Cd 的上升趋势，这可能是厌氧条件促进了秸秆腐解过程中酚醛-木质素残留物的积累[35]，这些物质与土壤有效态Cd 发生沉淀、螯合作用，部分螯合物还可以与根际游离重金属离子形成稳定的金属螯合物复合体，降低其活性及毒性[36]。另有研究表明，秸秆添加有助于土壤交换性酸降低，并且在秸秆腐解过程中产生的NH+4通过影响环境pH 间接影响到土壤Cd 的有效性[37]。小麦秸秆还田与土壤有效态Cd 之间并不具有指向性的影响，并且由于影响因素众多，呈现出复杂的相互作用。

本研究中随着秸秆还田量的变化，DGT提取的土壤有效态与CaCl2提取的可交换态Cd 与稻谷分布呈显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）正相关，而EDTA 提取的有效态Cd 和水稻各组分Cd 含量均没有显著的相关性。郑春荣等[38]在研究3 种土壤EDTA 提取Cd与水稻各部位吸收Cd中发现，两者有极显著相关性，与本研究结果并不一致，这可能是其控制变量为土壤类型，与本文的控制秸秆还田量不同的原因。国外报道在对大田水稻土壤Cd、Zn、Cu、Ni、Pb 的研究中发现，DGT 测定浓度受土壤性质的影响较小，体现了土壤因素（如pH、有机质等）对重金属有效性的影响，表明DGT 是一种更有效的有效性分析方法[39]。而国内亦有研究表明，评价Cd-Zn 复合污染土壤中Cd 的有效性时，DGT 法优于传统的化学提取法[40]。但是也有学者认为，传统化学提取法各自的适用条件亦不相同。例如以CaCl2为代表的中性盐提取的是交换态重金属，EDTA 可以提取碳酸盐、铁锰氧化物结合态和部分有机结合态重金属。综上所述，就秸秆还田量变化而言，DGT法较经典的化学提取法能更好地评价土壤Cd的有效性。