小麦-华山新麦草异附加系的细胞遗传学和分子标记辅助鉴定

张德时，王斯文，王长有,2，王艳珍，陈春环，吉万全,2，张 宏,2

(1.西北农林科技大学农学院，陕西杨凌 712100； 2.农业部作物基因资源与种质创新陕西科学观测实验站，陕西杨凌 712100)

小麦(TriticumaestivumL.)作为我国主要粮食作物，发展小麦生产对保障我国粮食生产和安全有重要作用[1]。但遗传背景日趋狭窄和骨干亲本单一[2]的问题制约小麦育种研究，不利于小麦生产。利用远缘杂交将小麦近缘种作物的优异基因导入小麦，可强化种质资源的原始积累，进而推动创新性品种的培育和生产[1]，不断提高小麦产量和品质[3]。

华山新麦草(Psathyrostachyshuashanica，2n=2x=14,NsNs)主要分布于陕西华山地带，是珍稀农作物野生亲缘种[4-5]。华山新麦草具有抗病、耐寒、耐瘠薄等众多优异性状，是小麦抗逆、抗病基因库[6-7]，如华山新麦草中的果聚糖合成酶(6-SFT)可使烟草增强对非生物胁迫的耐受性[8]，其含有的高分子量谷蛋白可影响小麦品质[9]，将华山新麦草的优良性状基因引入小麦可改善小麦抗病性和贫瘠土壤的耐受性[7,10-11]。在近年来的研究中，如Du等[12-15]报导的1～7Ns附加系和2Ns(2D)代换系以及王秀娟等[16]研究的代换系在抗条锈病和叶锈病、株高和小穗等农艺性状上都有优异表现，既为育种工作者提供了更多可选择的中间育种材料和种质资源，也证明了华山新麦草染色体的导入会给小麦带来许多优异的农艺性状。

小麦条锈病是由条锈菌(Pucciniastriiformisf.sp.tritici(Pst))引起的严重病害[17]，可通过空气传播造成小麦20%～50%的产量损失[18]。在小麦抵抗条锈菌侵染的长期过程中，国内许多抗性基因逐渐失去了抗性，如Yr1、Yr2、Yr3、Yr9、Yr10、Yr24和Yr26[19]，这与条锈菌小种的频繁变异有关[19-20]。因此需不断寻找新抗病基因和抗病品种，有效防控病害和减少作物损失[21]。利用小麦野生近缘种中的丰富基因资源，不断创制新抗病材料，无疑是小麦育种中重要的基础性工作 之一。

本课题组前期利用普通小麦7182和华山新麦草的BC1F9代植株获得三个稳定的小麦-华山新麦草衍生系：H1133、H4122和H1423。本研究利用细胞学鉴定、原位杂交鉴定、分子标记分析、形态学鉴定等方法，分析这3个衍生系中的华山新麦草遗传物质，评估它们的育种和抗病价值，以期为后续研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试材料为普通小麦品系7182(2n=6x=42,AABBDD)、华山新麦草(2n=2x=14,NsNs)以及小麦(7182)-华山新麦草衍生系H1133、H4122和H1423，感病对照品种辉县红。以上材料由西北农林科技大学农学院染色体工程实验室培育和提供。2016-2019年将试验材料按照家系点播种植于西北农林科技大学试验地(陕西杨凌)，目标单株套袋自交获得后代种子。条锈菌小种CYR32和CYR33，由西北农林科技大学植物保护学院提供。

1.2 细胞学鉴定

于2018和2019年3-4月份，取田间材料的根尖和幼穗。将根尖在冰水混合物中处理24 h，卡诺固定液Ⅰ(乙醇∶冰醋酸= 3∶1，V/V)处理2 d，1%醋酸洋红染色，45%醋酸压片，镜检。幼穗用卡诺固定液Ⅱ(乙醇∶氯仿∶冰醋酸= 6∶3∶1，V/V/V)处理3 d，用1%醋酸洋红染色压片，镜检。

1.3 原位杂交鉴定

染色体制片：将供试材料种子放入垫有2层湿润滤纸的培养皿中，在23 ℃恒温黑暗培养箱中进行种子发根处理，待根长至2～4 cm时剪下，N2O处理2 h，90%醋酸冰上固定10 min，置于70%的乙醇中-20 ℃保存。参照Han等[22]方法制备滴片，混合酶液(1%纤维素酶和2%果胶酶)中 37 ℃处理57～59 min(酶解时间因材料而异)。70%乙醇冲洗3次后破碎并离心，除去乙醇，加20 μL冰醋酸，涡旋，取10 μL滴于载玻片上，镜检，合格样品备用。

探针制备：用CTAB法[23]提取华山新麦草基因组DNA，以切口平移法标记华山新麦草基因组DNA探针。参考Tang等[24]的方法，由上海英骏(Invitrogen)生物技术有限公司合成寡核苷酸探针Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2。

原位杂交：参考Lukaszewski等[25]和Yang等[26]的方法，以华山新麦草基因组DNA为探针对材料进行基因组原位杂交(genomicinsituhybridization,GISH)分析；参考Tang等[24]的方法，以寡核苷酸序列Oligo-pTa535(红色)和Oligo-pSc119.2(绿色)为探针对材料进行荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)分析；以1:1的比例混合FISH探针与GISH探针，按照GISH程序对材料进行FISH-GISH同步杂交分析。用OLYMPUS BX-53荧光显微镜进行镜检，利用DP800 CCD(OLYMPUS)系统进行图像采集和合成，用软件Adobe Photoshop CS6进行图片处理。

1.4 EST和PLUG标记分析

依据网站http://wheat.pw.usda.gov/SNP/new/pcr_primers.shtml、GrainGenes公布的引物信息和部分发表文献[12-15,27]中的引物信息，选取位于小麦7个部分同源群上的72对EST-STS引物和88对PLUG(PCR-based landmark unique gene)引物(由北京奥科鼎盛生物技术有限公司合成)对普通小麦7182、华山新麦草、H1133、H4122和H1423进行PCR扩增分析。PCR扩增体系和程序参考Zhang等[28]的方法。

1.5 形态学鉴定和抗病性鉴定

在试验材料成熟期进行形态学鉴定，统计株高、分蘖、穗长、小穗数和小穗粒数等农艺性状，记录标准参照李立会等[29]方法。小麦-华山新麦草衍生系与普通小麦亲本之间的差异显著性用T测验方法进行统计分析。

在试验材料幼苗期时，于西北农林科技大学试验田对诱发行辉县红接种条锈菌小种CYR32和CYR33的混合菌种。当感病对照辉县红充分发病后，用0～4级分级标准[30]观察并记录7182、华山新麦草、H1133、H4122和H1423的条锈病反应型，0级为免疫，0;级为近免疫，1级为高抗，2级为中抗，3级为中感，4级为高感。

2 结果与分析

2.1 细胞学鉴定结果

观察试验材料的花粉母细胞，发现在减数第一次分裂中期，H1133(图1a)、H4122(图1b)和H1423(图1c)的染色体构型均为22个二价体；观察试验材料的根尖体细胞，发现H1133(图1d)、H4122(图1e)和H1423(图1f)的染色体数均为44条。各材料的细胞统计数均达到30以上，可以初步判定H1133、H4122和H1423具有细胞学稳定性，且携带44条染色体并能稳定配对。

图1 H1133、H4122和H1423的花粉母细胞(a-c)和根尖体细胞(d-f)镜检结果

2.2 原位杂交鉴定结果

以华山新麦草基因组DNA为GISH探针(绿)，以Oligo-pTa535(红)和Oligo-pSc119.2(绿)为FISH探针对H1133、H4122和H1423根尖体细胞进行同步原位杂交鉴定，将结果与Tang等[29]的中国春核型图对比。发现H1133(图2a)、H4122(图2b)和H1423(图2c)均含有普通小麦的42条染色体和2条华山新麦Ns染色体。

以华山新麦草基因组DNA(绿色)为GISH探针,以Oligo-pTa535(红色)、Oligo-pSc119.2(绿色)为FISH探针对根尖体细胞进行同步原位杂交，箭头代表Ns染色体。

2.3 EST和PLUG标记分析结果

为明确各衍生系含华山新麦草Ns染色体所属同源群，利用72对EST-STS引物和88对PLUG引物分别对H1133、H4122和H1423的Ns染色体进行部分同源群归属验证。将筛选的特异性标记进行分类统计(表1)，发现第三同源群中的CD454742(图3a)、BF473348(图3b)、CD454575(图3c)、TNAC1326(图3d)、TNAC1248(图3e)可以特异性扩增H1133中华山新麦草特异条带；第五同源群中BE499166(图4a)、TNAC1588(图4b)、TNAC1503(图4c)可以特异性扩增H4122中华山新麦草特异条带；第七同源群中BE637663(图5a)、BG274576(图5b)、BE591127(图5c)、TNAC1957(图5d)、TNAC1821(图5e)可以扩增出H1423中华山新麦草特异条带。这说明H1133、H4122和H1423分别携带华山新麦草3Ns、5Ns和7Ns染色体。结合细胞学和原位杂交结果，认为H1133、H4122和H1423为3Ns、5Ns和7Ns异附加系。

表1 第三部分、第五部分和第七部分同源群的EST和PLUG标记Table 1 EST and PLUG markers mapped on homeologous group 3,group 5 and group 7

2.4 形态学鉴定和抗条锈病鉴定结果

为了评价各附加系在育种和抗病研究中的价值，对H1133、H4122和H1423的农艺性状如株高、分蘖、穗长、小穗和小花等进行了观察和统计(表2)。比较发现H1133、H4122和H1423的平均株高比亲本7182低约10 cm。H1133和H4122的平均分蘖比7182多1～2个，而H1423少2个。H4122和H1423的平均穗长约11 cm，较亲本7182略有增加，T测验结果差异显著 (P<0.05)。植株性状对照如图6所示，各附加系的穗型变为纺锤型。

表2 H1133、H4122、H1423和7182的农艺性状Table 2 Agronomic traits of H1133,H4122,H1423 and 7182

M：DL2000；1：7182;2:H1133;3:华山新麦草;4:华山新麦草;5:H1133;6:7182；a：CD454742标记；b：BF473348标记；c：CD454575标记；d：TNAC1326标记；e：TNAC1248标记；箭头所指为华山新麦草特异带。

M：DL2000；1：华山新麦草;2:H4122;3:7182；a：BE499166标记；b：TNAC1588标记；c：TNAC1503标记；箭头所指为华山新麦草特异带。

M：DL2000；1：7182;2:H1423;3:华山新麦草;4:华山新麦草;5:H1423;6:7182；a：BE637663标记；b：BG274576标记；c：BE591127标记；d：TNAC1957标记；e：TNAC1821标记；箭头所指为华山新麦草特异带。

成株期抗条锈病鉴定结果(图7)表明：H1133、7182和辉县红表现为感病，华山新麦草、H4122和 H1423表现为抗病。根据材料系谱推测H4122和H1423的抗性来源为华山新麦草。

1：7182;2:H1133;3:H4122;4:H1423.

1：华山新麦草(IT0);2:H1133(IT3);3:H4122(IT0;);4:H1423(IT0);5:7182(IT3);6:辉县红(IT3)。

2.5 探针的特异性检验结果

结合细胞学技术和分子技术，鉴定获得了3Ns异附加系H1133、5Ns异附加系H4122和7Ns异附加系H1423。为了进一步研究这些导入的Ns染色体的特性，以华山新麦草基因组DNA(绿)、Oligo-pTa535(红)和Oligo-pSc119.2(绿)为探针，对各材料进行先FISH后GISH的鉴定。对比发现，FISH探针在H1133(图8a)、H4122(图8b)和H1423(图8c)中的Ns染色体上无特异信号，这说明Oligo-pTa535(红)和Oligo-pSc119.2(绿)无法有效区分3Ns、5Ns和7Ns染色体。

箭头指示Ns染色体。

3 讨 论

导入外源染色体的材料在染色体互作研究中有重要意义[31]，可使植株表型产生多种变化，如华山新麦草Ns染色体的导入使H1133、H4122和H1423株高降低、小穗增多，而矮秆、多花等性状都能直接影响小麦的产量[32-33]。利用远缘杂交技术将近缘种作物携带的优异基因转入小麦，是拓宽小麦遗传背景的有效方法。但附加系中整条染色体的导入常引入不利性状的基因，这意味着H1133、H4122和H1423需进一步改良为易位或渗入系，才能提高其利用价值，如Kang等[34]创制的易位系k-13-835-3具有多籽粒和抗条锈病的优良性状。而前人的研究给我们指引了一个新方向，如Zhang等[35]利用60Co-γ对附加系进行辐射处理，将携带种子贮藏蛋白基因的簇毛麦1V染色体片段导入中国春，提高了面包品质；Zhang等[36]利用同样方法将冰草的6P染色体片段导入小麦，创制的易位系显著提高了小麦千粒重和穗长。因此，利用辐射处理不同的华山新麦草Ns附加系材料，可获得大量的拥有优异农艺性状的易位系育种材料。总之，华山新麦草是小麦育种研究中的重要基因资源库，多样的附加系材料更丰富了小麦的育种资源，为进一步改良和利用华山新麦草中的优异基因奠定了基础，但后续研究工作仍需我们长期的探索。

在本研究中，探针Oligo-pTa535和Oligo-pSc119.2的组合无法有效区分3Ns、5Ns和7Ns染色体，间接证明了Ns组染色体与中国春染色体组有着不同的寡聚核酸偏好性。王丹蕊等[37]利用寡核苷酸探针套鉴别长穗偃麦草和中间偃麦草染色体的研究，为本研究进一步利用多样化的探针组合或新的寡核苷酸探针对不同Ns染色体的快速鉴别提供了借鉴和参考。此外，基因组测序和分析技术的完善为开发新的寡聚核酸探针提供了契机，而本研究创制的附加系材料为通过基因组学开发探针提供了基础材料。在抗条锈病鉴定中，H4122和H1423对条锈病小种CYR32和CYR33混合菌种田间表现为抗病。H1133的田间表现与Du 等[13]的3Ns附加系抗条锈病的鉴定结果存在差异，可能是小种差异或材料遗传背景差异导致的；Du 等[14]的7Ns附加系研究中未提及有关条锈病抗性的研究，所以本试验对H1423的研究是对前人成果的补充；马东方等[40]在华山新麦草易位系H9015-17的5DL上发现了一个新的抗性基因YrHua1，H4122中的抗性基因是否是其等位基因或华山新麦草的新抗病位点，则需要进一步分析研究。总之，普通小麦-华山新麦草附加系H1133、H4122和H1423为育种者提供了更多的选择机会。