胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离方法及优化

李燕，冯杰，聂宇，王玉瑶

心血管病是威胁人类健康的第一杀手[1]。心肌细胞作为心脏研究的焦点，长期以来被用作心脏生理学和病理学的研究工具[2]。虽然商品化的心脏细胞系，如HL-1 细胞的获取及操作更为方便[3]，但体外分离的原代心肌细胞在结构和功能上与心脏的生理及病理机制具有更好的相关性。因此，掌握心肌细胞体外分离技术至关重要。

随着年龄增长，心肌细胞的形态及功能均会发生很大的变化。在胚胎期及出生后7 d 内，心肌细胞具有增殖能力，随后这种自我增殖能力丧失[4]。因此，分离不同发育阶段（胚胎期至成年期等）的心肌细胞可为再生医学以及临床治疗提供强有力的支撑条件。

针对胚胎期或某一特定年龄段小鼠的心肌细胞体外分离方法已多较有相关报道[5-6]。但目前鲜有研究系统性、比较性地分析胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞的体外分离方法。本研究将系统性、比较性地分析胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的各种方法，并对其进行条件优化，以期得到不同年龄段小鼠心肌细胞分离的最佳方法，从而获得纯度高、活性好且形态佳的心肌细胞。

1 材料与方法

1.1 实验动物

不同胎龄及出生后年龄的无特定病原体级C57BL/6 小鼠（北京维通利华实验动物技术有限公司）56 只，包括怀孕14.5 d（E14.5）胚胎期小鼠（n=6）、新生1 d 龄（P1）小鼠（n=20）、出生后4 d（P4）小鼠（n=12）、出生后7 d（P7）小鼠（n=12）、成年小鼠（出生后56 d，P56，n=6）。

1.2 心肌细胞体外分离方法

1.2.1 胰酶消化法

将E14.5 的C57BL/6 雌鼠6 只断颈处死，剖腹取出胚胎，体式显微镜（蔡司Stemi 305，德国）下取出胚胎小鼠心脏，去除心房组织后放入0.25%含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶（Gibco 公司，美国）中，37℃消化心脏，每隔3～5 min 轻弹1 次，弹3 次后用含10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco 改良Eagle 培养基（DMEM）（Gibco 公司）终止消化，100 μm 滤网过滤，300×g 离心5 min，去上清，用含10%FBS 的DMEM 重悬细胞；运用差速贴壁法37℃静置90 min，上清即为心肌细胞悬液，可用于后续细胞培养实验。

1.2.2 新生鼠心脏解离试剂盒法（Gentle MACS 法）

将P1 C57BL/6 小鼠20 只断颈处死，开胸取出心脏，去除两个心房及结缔组织后，利用Neonatal Heart Dissociation Kit（Miltenyi 公 司，德 国） 及Gentle MACS Octo Dissociator 仪器（Miltenyi 公司，德国）消化心脏（含酶A：12.5 μl、酶P：62.5 μl、酶D：100 μl、缓冲液Y：25 μl、缓冲液X：23 000 μl）；程序结束后立即用含10% FBS 的DMEM 终止消化，100 μm 滤网过滤，300×g 离心5 min，去上清；轻弹细胞后加入红细胞裂解液（碧云天公司，上海）裂解红细胞，数分钟后用磷酸盐缓冲液（PBS）终止红细胞裂解过程，300×g 离心5 min，去上清，用含10% FBS 的DMEM 重悬细胞；运用差速贴壁法37℃静置90 min，上清即为心肌细胞悬液，可用于后续细胞培养实验。

1.2.3 Langendorff 灌流法Langendorff 法分离心肌细胞步骤简述如下：

（1）灌流系统的准备：提前开启灌流装置，开启加温器（固定在37℃左右），用去离子超纯水或蒸馏水循环，确保整个灌流装置没有气泡，以免堵塞血管，造成心肌坏死。同时，在循环时测灌流滴灌出口的温度，保持在37℃左右。待心肌灌流前20～30 min，换用新鲜灌注缓冲液进行循环。

（2）取小鼠心脏：6 只P56 C57BL/6 小鼠麻醉前15 min 将0.2 ml 肝素（1 000 U）进行腹腔注射作抗凝准备；按0.18 ml/10 g 的剂量，给小鼠腹腔注射三溴乙醇溶液进行麻醉处理；麻醉起效后，将小鼠固定在解剖台上。开胸，迅速找到心脏主动脉，左手持镊子将主动脉夹住，右手用剪刀靠上部剪下心脏；将剪下的心脏迅速放入预冷的灌注缓冲液中，立刻将心脏挂在灌流系统上。用灌注缓冲液灌流3～5 min，灌流速度约4～5 ml/min。

（3） 心肌组织的酶解：将胶原酶缓冲液接入灌流装置，约10 ml 胶原酶缓冲液进入灌流装置时开始计时，同时观察心脏心肌的柔软程度，最初心脏逐渐变硬、膨大、变白，之后慢慢变软、透明，用手随时感觉心脏的变软程度，大约40 min 时，剪下，于3 ml 胶原酶缓冲液（循环灌流时用过的）中，显微镊撕碎心室组织至 1 mm3大小，吸管反复吹打至无明显团块；培养皿中加入5 ml 终止缓冲液终止消化，吹打1 min，过滤至50 ml 离心管；室温静置20 min 后去上清，轻弹细胞，用灌注缓冲液重悬，低速离心或自然沉降后即得心肌细胞悬液。

1.2.4 非Langendorff 灌流法

取P4、P7 的C57BL/6 小鼠各6 只、P56 的C57BL/6 小鼠3 只，三溴乙醇溶液（0.18 ml/10 g） 麻醉，将小鼠仰卧位固定，开腹后拨开腹腔肠管，剪断下腔静脉和腹主动脉排空血液；开胸，将1 ml EDTA 缓冲液（含氯化钠130 mmol、氯化钾5 mmol、磷酸二氢钠0.5 mmol、4-羟乙基哌嗪乙磺酸10 mmol、葡萄糖10 mmol、二乙酰一肟10 mmol、牛磺酸10 mmol、EDTA 5 mmol；pH=7.8，试剂均购自美国Sigma 公司）注入右心室；游离升主动脉，止血夹夹闭（勿伤及主动脉根部）。眼科剪取下心脏后置于含10 ml EDTA 的培养皿中；左心室注射1 ml EDTA 缓冲液后转入含10 ml 灌注缓冲液（含1 mmol 氯化镁的EDTA 缓冲液，不含EDTA）的培养皿；再次向左心室注射1 ml 灌注缓冲液后转入含 10 ml 胶原酶缓冲液的培养皿；左心室再注射3～5 ml 胶原酶缓冲液（酶成分及终浓度：胶原酶Ⅱ0.5 mg/ml；胶原酶Ⅳ0.5 mg/ml；蛋白酶ⅩⅣ0.05 mg/ml），使心脏呈苍白色，质软。剪除心房及大血管组织，将心室转入含 1 ml 胶原酶缓冲液的培养皿；显微镊撕碎心室组织至1 mm3大小，吸管反复轻轻吹打至无明显团块后加入1.5 ml 终止缓冲液（含5% FBS 的灌注缓冲液）终止消化，轻轻吹打1 min，过滤至50 ml 离心管；20×g 离心5 min，弃上清，轻弹细胞，用灌注缓冲液重悬，低速离心或自然沉降后即得心肌细胞悬液。

1.3 心肌细胞大小及形态学检测

荧光显微镜（蔡司Axio Observer D1，德国）明场状态下成像检测心肌细胞大小，在20 倍放大倍数下选取3 个不同的视野测量心肌细胞大小，每个视野测量10 个心肌细胞并取平均值。使用Count Star 仪器（睿钰生物科技有限公司，上海）检测心肌细胞形态，细胞透亮的即为状态良好的心肌细胞。

1.4 心肌细胞免疫荧光染色

取细胞悬液涂片，4%多聚甲醛固定20 min，PBS-吐温20 （PBST） 洗2 遍，PBS 洗3 遍；用含0.3%聚乙二醇辛基苯基醚-X 100（Triton-X 100）的山羊血清封闭1 h；一抗稀释液稀释抗α 辅肌动蛋白（α-actinin）一抗抗体（Abcam 公司，美国）后，滴加到细胞表面，4℃过夜；常温复温1 h；PBST 洗2 遍，PBS 洗3 遍；二抗室温孵育1 h，PBST 洗2 遍，PBS洗3 遍；用含4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）的封片剂封片；激光共聚焦显微镜（蔡司LSM800，德国） 成像。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件对数据进行统计分析。数据符合正态分布，用均数±标准差（）表示，组间比较采用t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 用胰酶消化法分离得到的胚胎期小鼠心肌细胞存活率及形态

胚胎期小鼠心肌细胞存活能力较强，传统胰酶消化法即可获得存活率较高的心肌细胞。我们取10 个E14.5 小鼠心室组织加入400 μl 含EDTA的0.25%胰酶消化液中，15 min 后组织块基本消化完全。消化结束后用Count Star 仪器进行细胞计数并计算细胞浓度及存活率，同时观察细胞形态，结果发现，胰酶消化法可得到存活率约94%的心肌细胞，细胞透亮的即为状态良好的心肌细胞（图1A）；荧光显微镜明场下观察结果进一步确证细胞形态良好（图1B）。将心肌细胞悬液利用差速贴壁法进行纯化，得到较纯的心肌细胞，培养24 h后用心肌细胞标志物α-actinin 进行免疫荧光染色，用DAPI 标记细胞核，利用激光共聚焦显微镜观察，结果显示细胞具备心肌细胞典型形态结构（图1C）。

2.2 用心脏解离试剂盒法分离得到的新生小鼠心肌细胞存活率及形态

将P1 小鼠（n=20）的心肌细胞用Gentle MACS法按照试剂盒说明书进行分离（此方法适用于P1～P3小鼠心肌细胞分离）。此方法得到的心肌细胞存活率可达97%以上（图2A），且心肌细胞形态良好（图2B、2C），细胞长径为（40.5 ± 10.2）μm，细胞短径为（14.0 ± 0.5） μm。

图1 用胰酶消化法分离得到的胚胎期小鼠心肌细胞形态结构

2.3 用心脏解离试剂盒法和非Langendorff 灌流法分离得到的出生后4 d 和7 d 小鼠心肌细胞存活率和形态

出生后3 d 以上及成年小鼠心肌细胞均可用Langendorff 灌流法进行分离。本实验发现，P4、P7小鼠心脏较小，主动脉较细且极易断裂，不易将主动脉固定在注射器针头头部，故不适用Langendorff灌流法分离。因此，本实施首先运用Gentle MACS 法分离了P4、P7 小鼠心肌细胞，结果发现，心肌细胞存活率极低，镜下观察，几乎无杆状的心肌细胞（图3A、4A）。我们随即进一步用2016年文献报道的一种心肌细胞新分离方法——非Langendorff 灌流法对P4、P7 小鼠心肌细胞进行分离，发现得到的心肌细胞存活率可达70%～80%，细胞涂片后在荧光显微镜明场下观察及免疫荧光染色后镜下观察发现，细胞形态良好，杆状细胞较多（图3B～3D、图4B～4D）；P4小鼠心肌细胞长径为（56.9 ± 4.3）μm，细胞短径为（12.3 ± 5.6） μm；P7小鼠心肌细胞长径为（60.0 ± 4.0）μm，细胞短径为（15.8 ± 3.2）μm。

2.4 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分离得到的成年小鼠心肌细胞存活率和形态

本实验同时用传统Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分离P56 小鼠的心肌细胞，结果发现，两种分离方法均可得到存活率较高的杆状心肌细胞，且杆状率均在70%～80%之间，细胞存活率维持在70%左右（图5）。P56 小鼠心肌细胞长径为（70.2± 10.9）μm，细胞短径为（23.7 ± 6.4）μm。

图3 用心脏解离试剂盒法和非Langendorff 灌流法分离得到的出生后4 d 小鼠心肌细胞形态结构

图4 用心脏解离试剂盒法和非Langendorff 灌流法分离得到的出生后7 d 小鼠心肌细胞形态结构

图5 用Langendorff 灌流法和非Langendorff 灌流法分离得到的成年小鼠心肌细胞形态结构

3 讨论

胎期期及出生后不同年龄段小鼠原代心肌细胞的体外分离已成为心血管研究的基本方法和手段之一，对于研究心肌细胞的电生理学、信号传导、药物测试以及单细胞转录组学有着重要意义[7-15]。目前已有较为成熟的心肌细胞体外分离方法，但对于胚胎期及出生后不同年龄段小鼠尚少有系统性的研究。因此，研究者需查阅大量文献，即便按照文献步骤进行分离也易出现大量未知错误，重复性较差，并且需深入探讨诸多影响因素。本实验对不同年龄段小鼠心肌细胞体外分离的方法进行了系统性探索及优化，得到了不同时期小鼠心肌细胞分离的最优方法，获得了活性高且状态好的心肌细胞，且心肌细胞大小与文献报道相符[16]，能够满足心血管病发生、发展的多种生理生化实验及心脏组织工程学研究的要求。

根据已有文献报道以及本实验结果提示，胚胎期小鼠心肌细胞的体外分离方法为胰酶消化法，可得到存活率为85%以上的心肌细胞。该法所需胰酶体积及消化时间需根据心脏大小及心脏个数而定。一般来说，对于E14.5 小鼠来说，消化10 个心脏大约需400 μl 胰酶，37℃消化两次，每隔5 min 轻弹一次，即可获得存活率高的心肌细胞。对于新生小鼠（出生后1～3 d），心肌细胞的体外分离方法优先选择Gentle MACS 法，可获得活性约97%的心肌细胞。Gentle MACS 法中约20 个心脏用一个体系的酶量（2.5 ml），心脏较多时只需相应增加酶量即可。此外，在分离程序结束后应立即用预热的含10%FBS 的DMEM 终止消化，否则会因消化过度而影响心肌细胞存活。在每次离心结束后，应轻弹细胞，力度不宜过大，以免细胞破碎。

与Gentle MACS 法相比，出生后4 d 和7 d 的小鼠心肌细胞体外分离可优先选择非Langendorff 灌流法，分得的心肌细胞存活率在70%～80%之间。用非Langendorff 灌流法分离心肌细胞时，应严加把控注射酶的速度，速度过快会导致细胞断裂，杆状细胞率降低。此外，应用37℃预热好的酶液进行注射，以更好的模拟体内环境。P4、P7 小鼠可用低速离心的方法将心肌细胞沉淀，而P56 小鼠因心肌细胞体积较大且易断裂，应用自然沉降的方法进行细胞沉降，以去除非心肌细胞。

目前，Langendorff 灌流法分离成年心肌细胞方法已较为成熟，但是其影响因素较多，包括灌流系统的稳定性、灌流液的温度、酶的选择、浓度及消化时间及操作者的熟练程度等诸多细节均可能影响心肌细胞的状态[17-18]。本实验对缓冲液的各种成分间的配比进行了优化，发现如果在消化液中加入蛋白酶会在灌流过程中产生大量气泡，故最好不加蛋白酶。此外，应严格把控灌注缓冲液及胶原酶缓冲液pH值的稳定性，pH值发生改变会在很大程度上影响心肌细胞的活性。尤为重要的是，在整个灌流过程中应严格避免气泡进入心脏组织中。相反，非Langendorff 灌流法较为简便，易于操作，无需特定实验器材，只需注意注射酶液的速度，即可得到存活率较高的杆状心肌细胞。

总之，本实验系统研究了胚胎期及出生后不同年龄段小鼠心肌细胞的体外分离方法并进行了优化，得到的最优分离方法获得的心肌细胞纯度高、活性好、形态佳，且这些方法操作简便有效、重复性强，为心肌细胞的电生理学、信号传导、药物测试以及单细胞转录组学等诸多研究的开展提供了重要的基础。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突