白芍总苷预处理对缺血性脑损伤大鼠海马线粒体功能的保护作用研究∗

陈小丽 李红霞 杨 磊 徐 立

（中国人民解放军联勤保障部队第九○六医院，浙江 宁波 315040）

线粒体是细胞能量合成中心，是缺血性损害最主要的亚细胞靶区之一，其功能障碍所致能量耗竭而引发细胞凋亡和坏死是缺血性脑损伤直接和间接原因［1-2］。白芍总苷为毛茛科白芍属植物白芍的活性成分，既往张玥［3］、史晴晴［4］等研究发现白芍总苷能够通过改善血液流变学指标、抑制氧化应激和炎症反应而对缺血性脑损伤起到一定的保护作用，此外史晴晴等［5］还发现白芍总苷通过抑制细胞凋亡而对脑缺血中枢海马组织具有保护作用。本实验将探讨白芍总苷预处理对缺血性脑损伤大鼠海马线粒体功能的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级8周龄雄性SD大鼠，体质量（250±20）g，购自宁波大学实验动物中心［SYXK（浙）2014-0005］，动物批次号：20181009013。实验前清洁环境适应性饲养1周，光照/黑暗周期1∶1，恒室温（25±1）℃，相对湿度60%～70%；术前24 h禁食，饮水不限。

1.2 试药与仪器

1）药物：白芍总苷胶囊（宁波立华制药有限公司，批号：201804005），尼莫地平片（上海信谊天平药业股份有限公司，批号18062405）。2）试剂：ATP测定试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司）；MPTP开放度、△ψm检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。3）仪器：UV759型紫外-可见分光光度计（上海圣科仪器设备有限公司）；Chlorolab-2型氧电极（英国Hansatech公司）；UV759型紫外-可见分光光度计（上海圣科仪器设备有限公司）；H-7650型透射电子显微镜（日本Hitachi公司）；RM2125型石蜡切片机（德国Leica公司）；MTP-601F型荧光酶标仪［天美（中国）科学仪器有限公司］。

1.3 分组与造模

取120只大鼠按照随机数字表法随机分为假手术组，模型组，白芍总苷低、中、高剂量组和尼莫地平组，各20只。参照裴科阳等［6］报道，采用线栓法制备缺血性脑损伤大鼠模型：实施麻醉后沿颈部正中切口，剥离右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉（充分暴露三者分叉处），结扎颈外动脉，于分叉处近心端颈总动脉切口、插入线栓进颈内动脉，遇阻力止，深度距分叉处约18 mm，固定线栓后逐层缝合，消毒；假手术组除不插入线栓外，其余同模型组。

1.4 干预方法

白芍总苷低、中、高剂量组按50、100、200 mg/（kg·d）给药，尼莫地平组按1 mg/（kg·d）给药。药液配制：1）精确称取白芍总苷胶囊内充药物400 mg，加入0.9%氯化钠溶液10 mL制备白芍总苷溶液，质量浓度为40 mg/mL，并依次稀释制备20 mg/mL、10 mg/mL质量浓度的白芍总苷溶液。2）尼莫地平片研碎后，精确称取1 mg尼莫地平粉末并加入0.9%氯化钠溶液5 mL制备0.2 mg/mL的尼莫地平溶液。假手术组和模型组同步给予等体积（5 mL/kg）的0.9%氯化钠溶液。各组均于造模术前7 d开始灌胃给药，每日1次，共28 d。

1.5 标本采集与检测

1.5.1 线粒体呼吸功能测定 1）线粒体提取：各组分别随机取10只大鼠，深度麻醉后断头取脑，迅速剥取缺血侧海马组织，参照李富强等［2］报道的方法制备海马区线粒体，Lowry法检测蛋白浓度。2）改良Clark氧电极法［7］测定线粒体呼吸功能：连续描记Ⅲ态（R3）快速耗氧及腺苷二磷酸完全磷酸化后的Ⅳ态（R4）耗氧曲线，R3、R4耗氧速率比值为呼吸控制率（RCR），根据耗氧曲线计算磷氧比（P/O）和氧化磷酸化效率（OPR）。

1.5.2 线粒体ATP含量及游离Ca2+浓度测定 取制备的线粒体，通过超声波破碎后，采用比色法测定ATP含量。采用原子化学发光法，以CaCO3为标准，测定游离Ca2+浓度。

1.5.3 TEM观察超微结构 各组取剩余10只大鼠，麻醉后取大脑并进行4%多聚甲醛溶液组织固定，剥离海马，切割成约1 mm3小块后置4℃预冷的3%戊二醛溶液中固定2 h，PBS溶液浸洗30 min，置于1%四氧化锇溶液于4℃下再固定2 h，然后依次经梯度酒精脱水、还氧丙烷置换和环氧树脂Epon812浸透、包埋、聚合、光学显微镜下定位后，60 nm厚度超薄切片，经醋酸铀和柠檬酸铅染色后，由10 000倍TEM观察海马线粒体超微结构并拍照。

1.5.4 线粒体肿胀程度、膜流动性和膜总磷脂含量测定 1）线粒体肿胀程度［8］：取制备的线粒体悬液并加入适量蔗糖溶液，4℃低温离心（离心力7 000g，10 min）后去上清，重复1次。依次加入1 mL蔗糖溶液、1 μL CaCl2溶液（浓度200 mmol/L），通过紫外-可见分光光度计测定，A520越小，肿胀程度越高。2）线粒体膜流动性：参照孟伟峰等［9］报道，采用荧光偏振度法测定线粒体膜流动性，通过荧光酶标仪测定荧光偏振度P（激发波长362 nm，发射波长432 nm），微黏度（η）=2P（0.46-P），η越小，膜流动性越大。3）膜总磷脂含量：采用Trinder酶试剂盒测定线粒体膜总磷脂含量。

1.5.5 MPTP开放度、△ψm水平测定 1）MPTP开放度测定：遵照试剂盒说明，通过荧光酶标仪检测（激发波长540 nm，发射波长580 nm），荧光强度越高表示MPTP开放度越高。2）膜电位测定：遵照试剂盒说明，采用JC-1法、通过荧光酶标仪检测△ψm（激发波长485 nm，发射波长590 nm）。

1.6 统计学处理

应用SPSS15.0统计软件。计量资料以（）表示，多组间比较行单因素方差分析，两两比较行最小显著差异LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠海马线粒体呼吸功能指标比较

见表1。较假手术组，模型组呼吸功能指标R3、RCR、P/O、OPR降低且R4显著升高（P<0.01）。经白芍总苷中、高剂量预处理或尼莫地平预处理能够显著抑制R3、RCR、P/O、OPR值降低和R4值升高，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。较尼莫地平组，白芍总苷高剂量预处理组R3值显著降低（P<0.05），其他指标值两组间差异无统计学意义（P>0.05）。

表1 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体呼吸功能指标比较（±s）

表1 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体呼吸功能指标比较（±s）

与假手术组比较，∗∗P<0.01；与模型组比较，△P<0.05，△△P<0.01；与尼莫地平组比较，#P<0.05。下同

P/O组 别n OPR（nmol/min）161.08±22.53 64.35±10.07**71.46±11.32 98.43±13.15△136.70±23.81△△131.58±25.34△△假手术组模型组白芍总苷低剂量组白芍总苷中剂量组白芍总苷高剂量组尼莫地平组10 10 10 10 10 10 R3［nmol/（min·mg）］70.41±6.57 42.05±4.99**45.73±5.68 53.51±5.37△△64.15±5.60△△#56.28±5.36△△R4［nmol/（min·mg）］24.20±3.68 31.37±4.54**29.61±4.43 26.37±3.49△△24.28±3.45△△25.11±3.42△△RCR（%）2.79±0.35 1.35±0.23**1.58±0.29 2.10±0.40△△2.57±0.42△△2.49±0.38△△2.51±0.30 1.36±0.22**1.53±0.25 1.88±0.24△△2.34±0.31△△2.28±0.29△△

2.2 各组大鼠海马线粒体ATP含量及游离Ca2+浓度指标比较

见表2。较假手术组，模型组大鼠ATP含量显著降低且游离Ca2+浓度显著升高（P<0.01）；经白芍总苷中、高剂量预处理或尼莫地平预处理能够明显抑制ATP含量的降低和游离Ca2+浓度的升高，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；较尼莫地平组，白芍总苷高剂量组ATP含量显著升高且游离Ca2+浓度显著降低（P<0.05）。

表2 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体ATP含量及游离Ca2+浓度（±s）

表2 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体ATP含量及游离Ca2+浓度（±s）

组别假手术组模型组白芍总苷低剂量组白芍总苷中剂量组白芍总苷高剂量组尼莫地平组n 10 10 10 10 10 10 ATP（μmol/g）0.99±0.14 0.40±0.07**0.45±0.07 0.67±0.12△△0.84±0.15△△#0.69±0.13△△游离Ca2+（nmol/g）13.01±1.79 29.75±4.57**28.41±4.62 25.58±4.43△20.09±3.30△△#23.94±3.81△△

2.3 各组大鼠缺血侧海马线粒体超微结构改变

见图1。通过TEM观察发现，假手术组线粒体超微结构未发现明显异常，模型组呈现线粒体数量减少，基质透明化，膜磷脂层破坏，水肿、崩解，嵴断裂溶解、消失、间隙增大等明显的病理性形态结构改变；经白芍总苷和尼莫地平预处理能够不同程度地抑制缺血性脑损伤大鼠海马线粒体超微结构病变，以白芍总苷高剂量组最为显著。

图1 各组大鼠海马线粒体超微结构检查结果（10 000倍）

2.4 各组大鼠缺血侧海马区线粒体膜肿胀程度、膜流动性、膜总磷脂含量比较

见表3。较假手术组，模型组线粒体膜磷脂层被破坏，A520降低，表现为线粒体膜肿胀，η升高，表现为线粒体膜流动性降低，线粒体膜总磷脂含量降低（P<0.05或P<0.01）。白芍总苷中、高剂量组和尼莫地平组能够明显抑制A520值降低，并抑制η值升高，提示白芍总苷和尼莫地平预处理能够抑制线粒体肿胀、改善线粒体膜流动性，并且白芍总苷中、高剂量预处理能够明显抑制膜总磷脂含量降低，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。较尼莫地平组，白芍总苷高剂量组抑制线粒体肿胀作用显著升高（P<0.05），两组间膜流动性和膜总磷脂含量差异无统计学意义（P>0.05）。

2.5 各组大鼠缺血侧海马区线粒体MPTP开放度、△ψm比较

见表3。较假手术组，模型组MPTP开放度显著升高且△ψm显著降低（P<0.01）。经白芍总苷中、高剂量和尼莫地平预处理能够显著抑制MPTP开放度升高并抑制△ψm降低，与模型组比较差异具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。与尼莫地平组比较，白芍总苷高剂量组MPTP开放度显著降低、△ψm显著升高（P<0.05或P<0.01）。

表3 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体肿胀程度、膜流动性、膜总磷脂含量比较（±s）

表3 各组大鼠缺血侧大脑海马区线粒体肿胀程度、膜流动性、膜总磷脂含量比较（±s）

组别n假手术组模型组白芍总苷低剂量组白芍总苷中剂量组白芍总苷高剂量组尼莫地平组10 10 10 10 10 10肿胀程度（100×A520值）92.75±9.81 43.48±8.12**膜流动性［η值（Pa/s）］2.81±0.67 4.90±0.54**膜总磷脂含量（mol/mg）453.17±50.86 345.14±46.73**MPTP开放度［荧光强度（RFU）］23584.31±2491.28 40200.52±3517.35**△ψm［荧光强度（RFU）］40597.64±3651.32 25203.38±2758.40**50.25±9.68 68.31±9.76△△82.59±10.28△△#71.64±9.31△△4.48±0.59 4.06±0.63△3.38±0.50△△3.62±0.49△△367.58±44.39 395.70±46.25△416.49±51.37△393.16±41.82△37187.29±3538.60 33467.59±3407.52△△28761.42±3102.76△△##33991.38±3489.72△27425.13±2910.57 29011.47±2949.80△32384.63±3080.25△△#28588.59±2749.32△

3 讨 论

线粒体最重要的生理功能之一是通过呼吸链反应产生ATP而供给能量，线粒体受损所致能量代谢障碍是缺血性脑损伤发生发展的关键因素。本实验通过改良Clark氧电极法检测线粒体呼吸功能，显示缺血性脑损伤大鼠海马区线粒体呼吸功能降低，与李富强等［10］研究结论一致。线粒体呼吸功能降低将直接导致ATP合成受阻并间接影响能量依赖性的ATP酶活性，其中Na+-K+-ATP酶活性降低将导致Na+内流而引发Na+/Ca2+交换，使Ca2+进入线粒体，正常情况下Ca2+泵能够在Ca2+-ATP酶作用下被泵出而维持线粒体Ca2+平衡，但ATP合成受阻所致Ca2+-ATP酶活性降低而使线粒体Ca2+泵出受限而引发钙超载［11］，并且钙超载将抑制线粒体氧化磷酸化功能而抑制ATP合成，从而形成“ATP合成障碍-钙超载-ATP合成障碍”的恶性循环，最终加重缺血性脑损伤。本实验研究表明，与模型组、阳性药物（尼莫地平）预处理组比较，白芍总苷预处理能够显著抑制缺血性脑损伤大鼠海马线粒体呼吸功能、ATP含量降低，抑制游离Ca2+浓度升高，提示白芍总苷预处理具有保护缺血性脑损伤大鼠海马线粒体功能的作用。

线粒体是易受缺血性脑损伤累及的细胞器之一，而线粒体结构完整是维持其功能的基础。为进一步探讨白芍总苷上述作用的机制，本实验通过透射电镜观察发现，海马区线粒体呈现数量减少，基质透明化，膜磷脂层破坏，嵴断裂溶解、消失、间隙增大等明显的超微结构病变，该结果与 Jankauskas SS［12］、余婷［13］等的研究结论一致。此外，缺血性脑损伤将导致线粒体膜肿胀程度升高、膜流动性降低、膜磷脂含量降低。线粒体为膜性细胞器，其生理功能依赖膜结构的完整性，而上述3项指标能够反映线粒体膜完整性及其功能。本研究结果显示，白芍总苷预处理能够有效抑制海马区线粒体超微结构病变和膜病变。

△ψm对维持线粒体功能起着关键作用，其与ATP合成密切相关。Alizadeh R等［14］研究发现△ψm降低将直接导致ATP合成减少并影响正常生命活动。MPTP是一种非特异性通道，当膜完整性遭到破坏时MPTP开放度升高，致使正常生理状态下不能通过的大分子量离子自由通过，破坏离子平衡，此外李强等［15］研究发现MPTP开放度升高将导致△ψm下降、释放促凋亡蛋白而触发线粒体凋亡通路。本研究发现，经白芍总苷预处理能够有效抑制缺血性脑损伤大鼠海马区线粒体△ψm的降低和MPTP开放度的升高。

综上所述，白芍总苷预处理具有保护缺血性脑损伤大鼠海马线粒体功能的作用，其机制可能与抑制线粒体超微结构病变及保护线粒体膜完整性有关。