骨伤康颗粒对兔桡骨骨折模型VEGF、NO及ALP表达的影响∗

黄孝斌 黄 河 杨宏泉

（湖北省洪湖市人民医院，湖北 洪湖 433200）

桡骨骨折是临床常见的骨折之一，多由暴力、累积性劳损等因素造成。骨折愈合是指骨折断端间的组织修复反应，是恢复骨的正常结构和正常功能的愈合反应。骨折愈合是目前骨科康复研究的热点和难点，加速骨折愈合是医学界的重要课题［1-2］。西医多采用物理因子治疗，效果不明显。中医药治疗骨折历史悠久，疗效良好，具有显著优势，多以活血化瘀药为主［3］。骨伤康颗粒具有活血祛瘀、消肿止痛之功效，用于骨折、脱臼与软组织扭挫伤，在我院取得良好的临床疗效。本研究通过建立兔桡骨骨折模型，探讨骨伤康颗粒对桡骨骨折家兔血清血管内皮细胞生长因子（VEGF）、一氧化氮（NO）、血清碱性磷酸酶（ALP）表达的影响，旨在为临床提供治疗参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级新西兰白兔，体质量（2.80±0.50）kg，雌雄各半，购于上海邦耀生物科技有限公司。动物置于（23±2）℃室温中，昼夜节律，自由饮水进食，适应环境7 d后于9∶00～17∶00进行试验。

1.2 试药与仪器 骨伤康颗粒为本院协定处方，其组成为：丹参15 g，三七9 g，红花、当归尾、甘草各6 g。药材均为本院中药房提供，加8倍量水煎煮2次，滤过，浓缩成0.25 mg/kg的煎煮液，放凉后待用。伤科接骨片（大连美罗中药厂有限公司）、青霉素（石药集团中诺药业有限公司）、3%戊巴比妥钠（国药集团化学试剂有限公司）。苏木素-伊红（HE）染色试剂盒由北京索莱宝科技有限公司提供。VEGF、NO、ALP ELISA试剂盒均购于武汉博士德生物技术有限公司；其他试剂均为分析纯，购于天津市广成化学试剂有限公司；氯化钠注射液由山东康宁药业有限公司提供（批号：07112133），实验用水为超纯水。东方红F30-IIF200max X线摄片机（北京医用射线机厂），WDW-100万能电子材料试验机（深圳市凯强利试验仪器有限公司），TD5A-WS/TD5AWS型低速离心机（湖南湘仪离心机有限公司）、DPX-IQ型双光子骨密度测定仪（日本OLYMPUS公司），超低温冰箱（冠森生物科技（上海）有限公司），电子天平（上海良平仪器有限公司），控温水浴箱GKC（上海苏达实验仪器有限公司）。

1.3 分组与造模 家兔随机分为空白组、模型组、阳性组、骨伤康组，每组15只。各组家兔在自然光线下，以标准饲料和无菌蒸馏水喂养。空白组未经任何处理，其余各组家兔参考文献［4］制定兔桡骨骨折模型：3%戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉家兔后，剪去前腿腿毛，消毒后，切开皮肤暴露桡骨，采用万能材料试验机制造桡骨骨折模型，不予固定，缝合伤口。3 d后肌肉注射40万U青霉素钠，每日1次。分笼饲养，自由活动进食。

1.4 给药方法 建模成功后，阳性组给予伤科接骨片0.5 g/kg灌胃，骨伤康组给予骨伤康颗粒灌胃，剂量2.5 g/kg，空白组和模型组灌胃等体积蒸馏水，均每日1次，连续4周。

1.5 观察指标 1）X线表现：4周后，拍摄桡骨正侧位X线片，观察骨缺损区的骨痂和骨连接情况，进行X线肉眼评价。“±”表示骨质正常；“+”表示骨折处断开清晰，无骨痂阴影；“++”表示骨折断处形成纤维骨痂，呈云雾状阴影；“+++”表示骨折断处骨痂生长丰富，骨折线接近消失；“++++”表示骨折断处完全连接，接近骨化。2）骨密度和骨矿含量的测定：X线检测后，采用DPX-IQ型双光子骨密度测定仪测量骨缺损区新骨的骨密度以及骨矿含量。生物力学检测：取家兔右侧桡骨标本，用万能电子材料试验机进行整骨三点弯曲试验，跨距40 mm，加载速度为5 mm/min，最大载荷为20 kg，采用计算机自动描记桡骨的载荷，变形曲线以及抗弯强度。3）VEGF、NO及ALP水平检测：采取血清，双抗体夹心-ELISA法定量测定VEGF，比色法间接测定血清中的NO浓度，直接法检测血清ALP含量，严格按照说明书操作。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（）表示，组间比较采用独立样本t检验，计数资料以n（%）表示，应用χ2检验；组内比较采用配对t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组家兔X线评分比较 见表1，图1。4周后，X线片结果显示阳性组和骨伤康组兔的骨痂密度、骨缺损填充度以及骨痂量明显好于模型组，两组兔的X线评分明显高于模型组（P<0.05），但两组间比较无明显差异（P>0.05）。

表1 各组兔桡骨的X线评分结果比较（n）

图1 各组家兔桡骨骨折X线图像

2.2 各组家兔生物力学检测结果 见表2。4周后，模型组生物力学指标明显低于空白组（P<0.05），给予药物治疗后，阳性组和骨伤康组生物力学指标明显升高，明显高于模型组（P<0.05）。

表2 各组兔桡骨的生物学性能测定情况比较（±s）

表2 各组兔桡骨的生物学性能测定情况比较（±s）

与阳性组比较，◇P<0.05。下同

组别空白组模型组阳性组骨伤康组n 15 15 15 15最大载荷（N）245.00±20.50 112.37±24.38*183.03±15.01*△203.24±20.14*△◇弯曲位移（mm）5.12±0.87 2.28±0.26*3.98±0.42*△4.65±0.67*△◇弹性模量（mPa）357.06±31.47 183.24±23.36*259.37±3.59*△275.64±34.12*△◇

2.3 各组家兔骨矿含量和骨密度比较 见表3。4周后，模型组兔桡骨的骨矿含量以及骨密度明显低于空白组（P<0.05），给予药物治疗后，阳性组和骨伤康组兔桡骨的骨矿含量以及骨密度明显升高，明显高于模型组（P<0.05），两组间比较具有明显差异（P<0.05）。

表3 各组兔桡骨的骨矿含量及骨密度比较（±s）

表3 各组兔桡骨的骨矿含量及骨密度比较（±s）

组别空白组模型组阳性组骨伤康组n 15 15 15 15骨矿含量（mg）501.25±38.27 327.28±20.76*416.98±29.02*△473.85±32.67*△◇骨密度（mg/cm2）180.32±19.47 125.24±9.66*157.37±13.59*△169.64±14.12*△◇

2.4 各组兔血清VEGF、NO及ALP表达水平比较 见表4。4周后，模型组兔的血清VEGF和ALP水平明显高于空白组，血清NO水平明显低于空白组（P<0.05）。给予药物治疗后，阳性组和骨伤康组VEGF和ALP水平明显低于模型组，血清NO水平明显高于模型组（P<0.05），两组间的血清VEGF、NO及ALP水平比较具有明显差异（P<0.05）。

表4 各组兔血清VEGF、NO及ALP表达水平比较（±s）

表4 各组兔血清VEGF、NO及ALP表达水平比较（±s）

组别空白组模型组阳性组骨伤康组n 15 15 15 15 VEGF（pg/mL）63.26±6.09 87.32±7.24*72.18±7.05*△68.75±5.94*△◇NO（μmol/L）54.53±7.67 19.52±3.85*43.76±5.54*△47.95±6.46*△◇ALP（pg/mL）55.14±4.59 90.43±13.12*74.62±11.74*△65.43±10.62*△◇

3 讨 论

桡骨骨折可引起骨折部位局部变形肿胀、剧痛以及瘀血等情况，可限制患者运动，严重影响其日常生活。VEGF为促血管形成因子，不仅能够刺激内皮细胞增殖，促进血管重建，还能够增强软骨细胞活性，其他促血管生成因子的血管重建作用的实现均与VEGF有关［5］。ALP主要由成骨细胞分泌，可反映成骨细胞的成骨能力［6-9］。NO是一种细胞间信息传递的重要调节因子，与骨组织细胞的功能密切相关，影响骨折愈合［10-12］。

中医学认为骨折后血瘀积于经脉不散，致使经脉受阻，影响骨折愈合的速度，治疗应活血化瘀。骨伤康颗粒以活血化瘀药为主，现代药理学显示，丹参有效成分丹参酮ⅡA、丹参素、丹酚酸B和儿茶醛等，可促进骨形成、间充质干细胞向成骨细胞及软骨细胞分化，促进骨折愈合、成骨细胞和软骨细胞增殖，抑制破骨细胞和抗骨组织以及无机元素代谢紊乱的作用。当归有效成分可直接作用于骨髓细胞，改善血细胞的生产环境，并有显著的止血止痛作用。三七有效成分三七总皂苷能有效抑制骨折后血液高凝状态，保护血管内皮，增加骨组织中b-FGF和VEGF的表达，进而促进骨折愈合。红花有效成分红花黄色素可降低血浆黏稠度，有效抑制血小板聚集，降低血小板内游离钙离子浓度，促进骨折患者围术期炎性反应因子的清除［13-15］。

本研究中，治疗4周后，X线片结果显示阳性组和骨伤康组兔的骨痂密度、骨缺损填充度以及骨痂量明显好于模型组，模型组最大载荷、弯曲位移以及弹性模量明显低于空白组，给予药物治疗后，X线评分明显高于模型组，阳性组和骨伤康组生物力学指标明显升高，两组间比较差异具有统计学意义。提示骨伤康颗粒可提高桡骨骨折的生物力学指标，促进骨折愈合。4周后，模型组兔桡骨的骨矿含量、骨密度以及血清NO水平明显低于空白组，血清VEGF和ALP水平明显高于空白组，给予药物治疗后，阳性组和骨伤康组兔桡骨的骨矿含量、骨密度以及血清NO明显升高，明显高于模型组，血清VEGF和ALP水平明显低于模型组，两组间比较具有明显差异（P<0.05）。提示骨伤康颗粒可提高骨矿含量、骨密度以及血清NO水平，降低血清VEGF和ALP水平。

综上所述，骨伤康颗粒可有效促进兔桡骨骨折愈合，其机制可能与降低血清VEGF和ALP表达，提高NO水平有关。