miR-363-3p靶向TWIST1调控上皮间质转化抑制非小细胞肺癌A549细胞迁移和侵袭

越来越多的研究表明，抑制上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）进程是抑制肿瘤转移的重要机制，而微小RNA（microRNA，miRNA）在此过程中发挥着重要的调控作用[1-3]。miR-363-3p是一种与肿瘤转移关系密切的miRNA，在结直肠癌、胃癌和甲状腺乳头状癌等肿瘤组织中表达下调，上调其表达可抑制癌细胞的迁移和侵袭[4-6]。有学者指出，miR-363-3p 在非小细胞肺癌中异常低表达，且其表达与淋巴结转移呈正相关，但其在癌细胞转移中的作用并不明确[7]。采用生物信息学软件预测发现，miR-363-3p 与EMT相关转录因子TWIST13'UTR存在互补的核苷酸序列，可能通过靶向TWIST1调控EMT进程影响非小细胞肺癌细胞的转移。本研究以非小细胞肺癌A549细胞为研究对象，通过观察miR-363-3p和TWIST1的关系，旨在阐明miR-363-3p 在非小细胞肺癌EMT进程和癌细胞转移中的作用，为改善和治疗非小细胞肺癌提供新的线索。

材料与方法

一、材料

人非小细胞肺癌A549细胞（中国科学院上海生命科学研究院）；胎牛血清（货号2104，杭州四季青公司）；RPMI-1640培养基（货号C22400500BT，美国Gibco公司）；胰蛋白酶（货号T0458，上海生工生物公司）；β-actin抗体（货号ET1702-52，华安生物公司）；TWIST1抗体（货号T6454MSDS，美国Sigma公司），Vimentin抗体（货号5741）、E-cadherin抗体（货号3195，美国Cell Signaling Technology公司）；辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠/兔二抗（货号926-32221，美国Li-Cor公司）；LipofectamineTM2000（货号11668-027，美国Introvgen公司）；Matrigel基质（货号356237，美国BD公司）；Transwell板（美国Corning公司）；PVDF膜（美国Bio-Rad公司）；miR-363-3p模拟物、miR-363-3p抑制剂及相应的阴性对照（上海GenePharma公司）；pcDNA3.1-TWIST1 过表达质粒和pcDNA3.1 空载体质粒（长沙赢润生物技术公司）；Dual-luciferase检测试剂盒说明书（美国Promega公司）；反转录试剂盒、Bradford蛋白浓度测定试剂盒（中国Beyotime公司）。

二、方法

1.细胞培养、分组与转染：人非小细胞肺癌A549细胞购于中国科学院上海生命科学研究院。采用含100 ml/L胎牛血的RPMI-1640培养基于5﹪CO2的37℃恒温培养箱中常规培养。实验分为：空白对照组（细胞未做任何处理）；模拟物对照组（转染miR-363-3p模拟物阴性对照）；模拟物组（转染miR-363-3p模拟物）；每组设置3个平行孔。转染前24 h，将长势良好的对数生长期A549细胞按照每孔6×105个细胞平铺于6孔细胞板上，于培养箱内常规培养过夜。严格按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书步骤按照实验分组将50 μmol/L的miRNA试剂转染至A549细胞中。待转染48 h后，收集各组A549细胞进行实验。后期实验另设：模拟物+pcDNA组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1 空载体质粒）、模拟物+TWIST1组（转染miR-363-3p模拟物和pcDNA3.1-TWIST1过表达质粒），每组设置3个平行孔。以LipofectamineTM2000转染后，收集各组细胞，采用进行 Western blot和Transwell 小室实验分别检测TWIST1过表达对miR-363-3p 高表达的A549细胞EMT、迁移和侵袭的影响。

2.RT-PCR检测miR-363-3p和TWIST1mRNA的表达：以Trizol 法提取待测A549细胞的总RNA后，采用Nanodrop 2000分析总RNA纯度。根据反转录试剂盒说明书步骤将RNA 进行逆转录，并将所得到的逆转录产物cDNA作为模板，U6或β-actin为内参进行PCR扩增，miR-363-3p和TWIST1mRNA的相对表达量采用2-ΔΔCT法进行计算。其中，由北京Tiangen Biotech公司合成的miR-363-3p、U6、TWIST1、β-actin 引物序列见表1。实验重复3次。

3.Western blot检测TWIST1和EMT相关蛋白Vimentin、E-cadherin的表达：向待测的A549细胞中加入裂解液裂解细胞获取总蛋白，并采用Bradford法对总蛋白定量。将其与上样缓冲液混合均匀后，置于沸水浴中煮沸3～5 min。按照每孔60 μg蛋白样品上样行SDS-PAGE电泳分离。转至PVDF膜后，以含有50 g/L脱脂奶粉的TBST溶液封闭1.5 h。加入1:500 稀释的一抗工作液4℃下结合反应24 h。次日经TBST溶液洗膜后，置于1:2 000稀释的二抗工作液中常温反应1 h。显影后，采用Image 软件分析目的蛋白的相对表达水平。目的蛋白的相对表达水平=目的条带灰度值/内参β-actin条带灰度值。实验重复3次。

4.Transwell 小室实验检测细胞的侵袭和迁移能力：侵袭实验：（1）将以培养液稀释后的Matrigel基质胶按照每孔80 μL 平铺于Transwell 小室的上室，37℃下充分融合备用；（2）取24孔细胞板加入600 μL 含10﹪胎牛血清的培养基，放上Transwell小室，并于上室内加入细胞悬液200 μL（细胞数为4×103个）；（3）放入培养箱内常规培养24 h；（4）将Transwell小室取出，采用4﹪多聚甲醛对转移并附着在上室下表面的细胞固定10～15 min，并以1 g/L结晶紫染色10～20 min；（5）洗去染色液后，风干并以显微镜进行观察。结果以随机选取的6个高视野视野中细胞数的均值表示。迁移实验：同侵袭实验步骤相似，无需进行第1步。实验重复3次。

5.miR-363-3p和TWIST1靶向关系的验证：转染前24 h，将长势良好的对数生长期A549细胞以105个/孔的密度接种至12孔细胞板上，待细胞生长至70﹪融合度时，参照LipofectamineTM2000转染试剂说明书步骤将百奥迈科生物技术有限公司构建的野生型（TWIST1-WT）和突变型（TWIST1-MUT）的TWIST13'-UTR 双荧光报告质粒分别与miR-363-3p模拟物/抑制剂和相应阴性对照共转染至A549细胞中。每组设置3个平行孔。转染48 h后，参照Dual-luciferase检测试剂盒说明书检测各组细胞的荧光素酶活性。实验重复3次。

三、统计学分析方法

采用SPSS22.0 软件进行统计学分析，A549细胞中miR-363-3p、TWIST1、Vimentin和E-cadherin表达水平、荧光素酶活性、侵袭细胞数和迁移细胞数以表示，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、转染后A549细胞中miR-363-3p表达升高而TWIST1表达降低

与空白对照组和模拟物对照组比较，模拟物组A549细胞中miR-363-3p表达水平升高，TWIST1mRNA和蛋白的表达水平降低，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；而空白对照组和模拟物对照组之间的miR-363-3p表达水平、TWIST1mRNA和蛋白的表达水平之间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）。（图1、表2）

图1 Western blot检测TWIST1蛋白的表达

表2 模拟物干预后A549细胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表达水平（±s，n = 3）

表2 模拟物干预后A549细胞中miR-363-3p 及TWIST1 mRNA和蛋白表达水平（±s，n = 3）

注：与空白对照组比较，aP ＜0.001；与模拟物对照组比较，bP ＜0.001；n为实验重复次数

分组 miR-363-3p表达量TWIST1 mRNA表达量TWIST1蛋白表达量空白对照组 1.00±0.08 1.00±0.06 0.81±0.05模拟物对照组 0.97±0.05 0.98±0.06 0.78±0.06模拟物组 3.82±0.45ab 0.39±0.02ab 0.42±0.02ab F值 114.067 142.223 65.215 P值＜0.001＜0.001＜0.001

二、TWIST1是miR-363-3p潜在的靶基因

采用TargetScan 软件预测发现，TWIST13' UTR区域有能够与miR-363-3p 互补结合的核苷酸序列（图2）。采用双荧光素酶报告基因实验检测发现，与模拟物对照组比较，模拟物组TWIST1-WT活性（1.00±0.10 比0.42±0.04）降低（t= 9.327，P= 0.001），与抑制剂对照组比较，抑制剂组TWIST1-WT活性（1.08±0.07比2.96±0.30）增高（t= 10.570，P＜0.001）。（图3）

图2 TWIST1 3' UTR 与miR-363-3p的结合位点

图3 模拟物及抑制剂干预细胞后双荧光素酶相对活性

三、miR-363-3p过表达抑制A549细胞EMT进程

Western blot检测发现，与空白对照组和模拟物对照组比较，模拟物组A549细胞Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白的表达水平增高，差异有统计学意义（P均＜0.05）；与空白对照组比较，模拟物对照组Vimentin和E-cadherin蛋白表达水平之间比较差异无统计学意义（P＞ 0.05）；与模拟物对照组比较，模拟物组A549细胞Vimentin蛋白表达水平降低，E-cadherin蛋白的表达水平增高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。（图4、表3）

图4 Western blot检测Vimentin和E-cadherin蛋白的表达

表3 miR-363-3p过表达对A549细胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相对表达水平（±s，n = 3）

表3 miR-363-3p过表达对A549细胞中Vimentin和E-cadherin蛋白的相对表达水平（±s，n = 3）

注：与空白对照组比较，aP ＜0.001；与模拟物对照组比较，bP ＜0.001；n为实验重复次数

分组 Vimentin蛋白表达量 E-cadherin蛋白表达量空白对照组 0.58±0.04 0.22±0.02模拟物对照组 0.55±0.05 0.25±0.03模拟物组 0.36±0.03ab 0.47±0.03ab F值 25.620 76.227 P值 0.001＜0.001

四、miR-363-3p过表达抑制A549细胞迁移和侵袭

Transwell 实验发现，与空白对照组和模拟物对照组比较，模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数减少，差异具有统计学意义（P均＜0.05）；与空白对照组比较，模拟物对照组迁移细胞数和侵袭细胞数之间比较差异无统计学意义（P均＞ 0.05）；与模拟物对照组比较，模拟物组迁移细胞数和侵袭细胞数减少，差异具有统计学意义（P均＜0.05）。（表4、图5）

表4 miR-363-3p过表达对A549细胞侵袭和迁移的影响（±s，n = 3）

表4 miR-363-3p过表达对A549细胞侵袭和迁移的影响（±s，n = 3）

注：与空白对照组比较，aP ＜0.001；与模拟物对照组比较，bP ＜0.001；n为实验重复次数

分组迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）空白对照组 85.75±5.45 128.26±6.15模拟物对照组 83.52±6.85 125.95±8.05模拟物组 53.05±4.50ab 71.64±5.75ab F值 30.990 68.106 P值＜0.001＜0.001

五、TWIST1逆转miR-363-3p过表达对A549细胞EMT、迁移和侵袭的抑制作用

与模拟物+pcDNA3.1组比较，转染pcDNA3.1-TWIST1过表达质粒后，miR-363-3p过表达的A549细胞中Vimentin蛋白的表达水平升高，而E-cadherin蛋白表达水平降低，A549细胞的迁移数和侵袭数增加（P均＜0.05）。（图6～图7和表5）

讨 论

表5 TWIST1 对miR-363-3p过表达的A549细胞EMT、迁移和侵袭的影响（±s，n = 3）

表5 TWIST1 对miR-363-3p过表达的A549细胞EMT、迁移和侵袭的影响（±s，n = 3）

分组 Vimentin蛋白表达量 E-cadherin蛋白表达量迁移细胞数（个）侵袭细胞数（个）模拟物+pcDNA3.1组 0.32±0.02 0.56±0.04 49.45±4.22 72.45±5.73模拟物+TWIST1组 0.42±0.03 0.38±0.03 67.52±5.05 108.35±6.56 t 值 4.804 6.235 4.756 7.139 P值 0.009 0.003 0.009 0.002

图7 Western blot检测Vimentin和E-cadherin蛋白表达

EMT是赋予肿瘤细胞迁移和侵袭能力的生物学过程，被认为是肿瘤复发和转移的主因。随着研究的不断深入，人们发现越来越多的miRNA 如miR-330、miR-4472和miR-194-5p 等在调控EMT过程中发挥着重要作用[8-10]。miR-363-3p是一个值得关注的miRNA，被认为具有潜在的抑瘤作用。miR-363-3p 高表达被认为是宫颈腺癌预后良好的重要预测指标[11]；肾癌中miR-363-3p表达缺失时可使致癌基因CREB1过表达，而引入miR-363-3p可通过下调CREB1表达抑制肿瘤细胞的增殖、迁移[12]。另外，有学者指出，miR-363-3p 在伴有淋巴结转移结直肠癌组织中经常下调，而下调miR-363-3p表达可通过靶向Sox4诱导EMT进程，促进癌细胞的迁移和侵袭[4]。

本研究采用TargetScan 软件预测发现，TWIST13' UTR区域有能够与miR-363-3p 互补结合的核苷酸序列，并通过双荧光素酶报告基因实验检测证实TWIST1是miR-363-3p的潜在靶基因。TWIST1是一种可诱导肿瘤EMT 过程的核转录因子，与恶性肿瘤转移关系密切[13]。TWIST1在非小细胞肺癌组织中高表达，在癌细胞的生长、侵袭和转移过程中发挥着重要的促进作用；另外减少TWIST1表达可通过抑制EMT 间质蛋白N-cadherin表达抑制癌细胞侵袭[14-16]。有研究指出，miR-363-3p 在非小细胞肺癌组织中异常低表达，且其表达与淋巴结转移呈正相关，可通过靶向PCNA抑制癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，但其是否通过靶向TWIST1调控EMT进程进而影响非小细胞肺癌转移[7,17]。

E-cadherin表达减少和Vimentin表达增多常被认为是发生EMT的重要标志[18-20]。有研究指出，E-cadherin 在淋巴结转移的非小细胞肺癌组织中表达降低，而Vimentin 则相反，EMT 可能在非小细胞肺癌的淋巴转移过程中发挥着重要作用[21]。通过构建miR-363-3p过表达的非小细胞肺癌A549细胞株，本研究发现miR-363-3p过表达可引起TWIST1和Vimentin表达降低，而E-cadherin表达升高，抑制EMT进程；同时，miR-363-3p过表达可明显减弱A549细胞的迁移和侵袭能力。此外，TWIST1过表达后，miR-363-3p 对A549细胞EMT、迁移和侵袭的抑制作用得以逆转。提示，miR-363-3p 可通过靶向TWIST1调控EMT抑制A549细胞的迁移和侵袭。根据相关文献报道，TWIST1 基因可能通过抑制Ecadherin蛋白表达，上调Vimentin蛋白表达促进了EMT，进而增强肿瘤细胞的转移能力[22-23]。然而其可能的机制有待于进一步研究。

综上所述，miR-363-3p 在非小细胞肺癌发生发展过程中具有抑制癌细胞迁移和侵袭的作用，而靶向TWIST1抑制EMT进程是其重要的机制之一。然而，非小细胞肺癌恶性转移的分子机制十分复杂，如何更全面的阐明miR-363-3p 在非小细胞肺癌发生发展中的作用还有待深入研究。