实验小鼠阴道膈及阴道闭锁的研究进展

李增民，徐 鹰，管观文，蔡茜茜，江伟华，任 震，唐建红

(1.赣南医学院 赣州市实验动物工程技术研究中心，江西 赣州 341000；2.江西农业大学 江西省动物营养重点实验室，江西 南昌 330000)

阴道膈及阴道闭锁是以雌性生殖道畸形为特征的疾病。在人类医学的研究中，妇女阴道闭锁的发病率为0.2‰～0.25‰，阴道斜膈发生率为0.1%～3.8%，阴道膈及阴道闭锁在不孕和反复流产病例中高达7%[1-4]，二者均是严重影响生殖健康和生活质量的疾病。阴道膈分类为阴道横膈、阴道纵膈和阴道斜膈，根据美国生育协会(American Fertility Society, AFS)分类标准[3-5]，将人类阴道纵膈和阴道斜膈归因于副中肾管侧面融合异常，阴道横膈归因于副中肾管垂直融合异常。根据AFS分类标准[3-5]，将阴道闭锁分为以先天性无子宫阴道为特征的副中肾管发育不良(MRKH综合征)、处女膜闭锁、泌尿生殖窦发育不良和副中肾管融合异常引起的阴道下段完全闭锁。处女膜闭锁是人类与灵长类动物特有的阴道闭锁类型，俗称“石女”、“石芯子”。阴道斜膈一部分转化为单侧性阴道闭锁，90%以上的阴道横膈将转化为阴道完全闭锁。目前实验动物学、兽医学研究报道的阴道膈病例大部分为阴道纵膈或斜膈。猫[6]、大鼠[7]、小鼠[8]极其罕见报道患有阴道横膈。哺乳动物中，除有袋目(如袋鼠)拥有双子宫双阴道(含阴道膈)属正常的生殖结构外，阴道膈及阴道闭锁均属生殖道畸形[1]。目前，阴道膈及阴道闭锁报道最多的是小鼠，其它动物的相关报道极为稀少[6,8-15]。原因在于：阴道膈及阴道闭锁是生殖缺陷性疾病，与流产、死胎、不孕密切相关；家畜及伴侣动物在长期的人工选种过程中已将这些影响繁殖性能的个体不断淘汰，净化了种群基因；而实验小鼠生命周期短、繁殖速度快，其雌性生殖道的异常发育现象极易被观察发现。小鼠的阴道膈及阴道闭锁是参照人类AFS标准进行分类的，目的是以实验小鼠作为人类生殖缺陷的替代者来进行胚胎发生学、解剖学形成机制、遗传学、病理学的相关研究。

在实验动物生产实践中，阴道膈及阴道闭锁的出现是一把双刃剑。一方面，阴道膈及阴道闭锁的出现会严重影响实验小鼠的选种和繁育，育种工作者需及时将缺陷小鼠甚至父母同胞从种群中淘汰；另一方面，研究人员又希望能培育出足够数量具有阴道膈及阴道闭锁缺陷表型的小鼠用以开展科学研究，解析潜在致病机制。随着基因功能的深入解析和基因编辑技术的快速发展，目前已基于C57BL/6J品系小鼠，成功培育有100%产生阴道闭锁表型纯合子小鼠Lhfpl2突变系[10]和91%产生阴道闭锁表型的β-cateninC429S突变系[9]。诸多研究报道显示，阴道闭锁的致病机制具有其复杂性，致病基因之间极有可能存在相互作用。如WU H等[11]研究发现，同时敲除Tyro3-/-、Axl-/-和Tyro-/-三种基因的小鼠阴道闭锁发病率为16.06%；Axl-/-和Mer-/-双基因敲除小鼠阴道闭锁发病率为4.0%；Mer-/-和Tyro3-/-双基因敲除小鼠阴道闭锁发病率约为3.7%；Mer-/-单基因敲除小鼠阴道闭锁发病率为2.5%[11]。偶有报道自发产生野生型阴道膈[8,12-16]及阴道闭锁小鼠[8,15]，且主要见于近交系小鼠中，极少有封闭群小鼠病例报道[15]。

简而言之，自发性产生的野生型阴道膈及阴道闭锁小鼠需经过生产种群世代繁育、人工筛选并经基因鉴定、纯化并分离形成突变系[8,12-16]。而阴道膈及阴道闭锁纯合子突变小鼠又很难通过近交繁育保种。所以，近五年外文报道的三种能产生50%以上雌鼠子代罹患阴道膈及阴道闭锁表型的小鼠均是通过基因工程等方法获取的：β-cateninC429S突变系小鼠是通过复苏冻存精卵(来源于日本筑波RIKEN生物资源中心)，体外受精，胚胎移植，代孕产出91%子代雌性小鼠雌激素抗性阴道闭锁[9]。Adamts18-/-小鼠是通过Cre/loxP重组酶系统基因打靶，制作杂合子，由杂合子兄妹互交产出纯合子子代雌性小鼠，使子代雌鼠50%同时出现雌激素抗性阴道纵膈及阴道闭锁[17]。LHFPL2G102E小鼠是通过购买美国杰克逊实验室的突变系小鼠经基因鉴定和蛋白质分析筛选出杂合子，由杂合子兄妹互交产出纯合子子代雌性小鼠，使子代雌鼠100%出现雌激素抗性阴道闭锁[10]。

1 阴道膈及阴道闭锁的胚胎发生学、解剖学形成机制

哺乳动物(包括人类)胚胎期均拥有一对苗勒管(起始于副中肾管)和一对沃夫管(起始于中肾管)，胚胎内苗勒管和沃夫管共同经历过起始、延伸、分化/退化后，至胚胎生长第10～15 d出现雌雄分化。小鼠在胚胎生长第9 d时沃夫管从中胚层起始生长，胚胎生长第11.5 d时苗勒管才从中胚层表面上皮内陷窝起始生长，循着沃夫管的尾端方向延伸2 d，此时沃夫管尾端已延伸4.5 d，至该小鼠胚胎生长第13.5 d时，正常发育情况下苗勒管和沃夫管同期抵达泌尿生殖窦，与之融合生长。雄性小鼠经历了沃夫管分化和苗勒管退化，形成雄性生殖系统。雌性小鼠经历了苗勒管分化和沃夫管退化，苗勒管分化成卵巢、附件、子宫、宫颈及阴道上段组织，泌尿生殖窦分化成阴道中下段[1-5,10]。

目前阴道膈的胚胎形成机制尚无定论，一种学说为沃夫管延伸异常引起一侧苗勒管移位，无法融合对侧苗勒管而分化形成双子宫腔体结构，而移位的苗勒管无法融合泌尿生殖窦最终形成盲端分化形成阴道斜膈；另一种学说则认为，阴道膈是苗勒管分化异常引起泌尿生殖窦的过度分化产生的赘生物[18]。而阴道闭锁的胚胎发生学则争论更为激烈，一种学说认为，人类的先天性无子宫的阴道闭锁是苗勒管无法完成正常分化引起的，而子宫卵巢可以正常发育的阴道上段完全性闭锁则被一种假说认为是苗勒管末端太短无法融合泌尿生殖窦造成泌尿生殖窦过度上皮性分化所形成的；还有部分学者认为是沃夫管退化不全造成两侧苗勒管末端无法融合泌尿生殖窦所形成；伴有发育正常的卵巢子宫的中下段阴道闭锁则被大部分学者共识为泌尿生殖窦的分化不良所形成[1-4,16]。目前文献记载的自发性小鼠阴道膈及阴道闭锁均伴有卵巢子宫的生长发育，卵巢子宫先天性缺失的阴道闭锁病例报道较少[8-15]。

2 阴道开口与雌激素信号的相关研究

雌性小鼠初生时阴道口是紧闭的。在雌性激素调控作用下，小鼠经历初情期后阴道口张开。这个过程中一旦下丘脑-垂体-性腺轴(H-P-O轴)出现改变，无法产生功能性卵泡造成雌性激素分泌不足，将会推迟阴道开口或者发生阴道闭锁。由于小鼠血量极少，在其一生中无法多次检测其血清激素水平，部分学者过去受自由激素假说的困扰，长期致力于雌性激素受体损伤(如卵巢子宫发育不全、肿瘤、雌雄同体等)的研究来证明阴道闭锁的成因。2005年，HAMMES等在gp330/megalin突变系世代近交获得杂合子Het/megalin+小鼠，再经兄妹近交获得纯合子Mut/megalin+小鼠，Mut/megalin+基因缺失小鼠在正常小鼠阴道开口期即便有外源性持续注射的雌激素提供信号，但是由于megalin蛋白失活出现阴道完全性闭锁[19]。这一结果挑战了自由激素假说所认为的只有游离类固醇才能进入靶细胞产生生物活性，而雌性激素被运输到了性激素结合球蛋白SHBG处成为了载体结合类固醇，只有血清雌激素水平达到一定剂量时，雌激素能够通过被动运输抵达信号通路终端才能启动阴道开口的观点；实际上巨蛋白megalin(一种生殖系统的内吞受体)结合雌激素的内吞途径信号传导，在实现阴道开口过程中也具有启动作用；这种实验方法所构建的基因缺失雌性小鼠与ZHAO F等报道的临床表现相一致。ZHAO F 等通过LHFPL2G102E系小鼠用Hammes的方法成功培育出Mut/Lhfpl2+纯合子基因缺失小鼠。位于小鼠第13号染色体的Lhfpl2基因所编码出的LHFPL2蛋白是一种在卵巢滤泡细胞和生殖道上皮细胞中高量表达的四跨膜蛋白，这种蛋白失活后小鼠表现出雌、雄性激素抗性，在有持续的性激素信号刺激下出现阴道闭锁(雌鼠)和输精管弯曲阻塞(雄鼠)的生殖缺陷[10]。

阴道开口是小鼠初情期开始的信号，也是雌性生命周期的重要节点。雌激素是调控各种雌性性别特征出现的上游信号分子，起总开关的作用。内分泌活动的病理性紊乱及人为注射雌激素受体拮抗剂均可以影响阴道开口的正常开放。因此，早期研究人员认为雌激素是促成阴道开口的充分必要条件， 而MURATA T等[9]、ZHAO F等[10]、HAMMES等[19]构建的基因工程小鼠充分证明了在持续的雌激素诱导下，阴道开口未必能如期发生。雌激素是促成阴道开口的最重要的必要条件而非充分条件。

3 与阴道膈及阴道闭锁基因表达密切相关的信号通路研究

随着人体胚胎早期发生的研究深入，阴道膈及阴道闭锁各种分型的确立，各种组织胚胎分化学说的不断出现、争论和融合；目前有关小鼠的阴道膈及阴道闭锁的主流研究观点认为应集中在下段阴道闭锁形成机制和细胞凋亡作用机制的研究上，具体可以分为突变基因表达、转录、功能蛋白质翻译的终止；细胞极化和内吞作用；细胞凋亡和信号转导通路的研究等。

目前文献记载的阴道膈及阴道闭锁致病基因及相关通路如表1所示：编码β-catenin蛋白的Ctnnb1基因的错义突变致使C57BL/6J小鼠内生殖器时空持续的Wnt信号传导而表现出性激素抗性雄性不育、雌性阴道闭锁[1]。在非经典的Wnt信号传导中，Wnt7a基因突变不仅可以造成CBA小鼠长有阴道膈，子宫角直径小且输卵管不弯曲，并且可以通过基因工程改造Wnt7a基因突变系小鼠子代体内持续产生已经发生点突变的梵高样蛋白2(van gogh-like 2)， 影响细胞骨架肌动蛋白的极化和scribble(Scrb1)定位的改变，造成上皮细胞顶面纤维化，诱发50%雌性小鼠出现阴道闭锁[19]。Pax8基因缺失不仅可以导致人类甲状腺发育不全，而且可以引起小鼠苗勒管分化异常，先天性阴道闭锁[20]。编码Adamts金属蛋白酶孤儿核受体家族中的Adamts18等位基因的缺失造成C57Bl6/Ola小鼠在发育过程中无法切割细胞外基质成分引起雌鼠50%出现阴道纵膈及阴道闭锁，同时造成100%雌雄小鼠在出现胚胎期晶状体囊破损晶状体外溢，肺塌陷等病理变化[17]。MAP3K1基因(也称为MEKK1)编码一个丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK激酶)，该激酶充当磷酸三联体的一部分来磷酸化MAPKs JNK，ERK和p38，尤其是JNK途径；MAPK途径可整合各种信号调控人与小鼠的苗勒管与沃夫管间的分化，影响胚胎早期性别分化；MAP3K1基因缺失C57BL/6J小鼠也会导致雌鼠罹患阴道膈和阴道闭锁及闭锁引起的阴道子宫积水综合征[21]。此外，TAM三联受体基因(Tyro3、Axl和Mer受体)敲除C57BL/6J小鼠也有报道通过介导酪氨酸激酶TAM受体信号通路造成2.5%～16.0%雌性小鼠发生远端阴道闭锁。与细胞凋亡家族蛋白类信号通路相关的基因缺失诱发小鼠出现阴道膈及阴道闭锁的有：Lhfp12基因在G102E位置出现点突变产生了一种四跨膜蛋白Lhfp12G102E(脂肪瘤HMGIC融合伴侣样蛋白-2)，可以引起性激素抗性雌雄C57BL/6J小鼠不孕不育，100%雌性阴道闭锁和70%雄性睾丸发育不良和附睾阻塞[11]；编码Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax、Bak、Bid、Bim基因和Puma基因同样也会诱导小鼠罹患阴道膈及阴道闭锁[18,22-24]；编码P63蛋白的基因缺失会导致雌性小鼠苗勒管胚胎期停止分化，先天性阴道闭锁[24]。

表1 阴道膈及阴道闭锁小鼠信息一览表

3.1 Wnt信号通路在经典Wnt信号通路和β-catenin细胞间隙传导通路中，β-连环蛋白信号传导调节着哺乳动物众多发育过程和体内内环境稳态[2]。β-cateninC429S错义突变使编码出来的β-catenin蛋白的中央犰狳重复中的半胱氨酸(Cys429)突变成丝氨酸(Ser)，启动了β-catenin与Wnt配体的蛋白复合物的微调开关，使内生殖器官存在持续的β-catenin信号传导从而雌性小鼠的下段阴道闭锁的出现[9]。

VANDENBERG等[25]利用Wnt7a突变系与T环[loop-tail (Lp)]工具鼠杂交，基因鉴定获得的Vangl2Lp/Lp及Vangl2Lp/-转基因鼠的研究证明了非典型Wnt信号也可通过梵高样蛋白2(van gogh-like 2)调控着雌性生殖道发育中的细胞极性。这一研究[25]表明：非典型Wnt信号诱导了阴道膈、阴道闭锁的形成，使Vangl2Lp/Lp小鼠在胚胎期18.5 d时输卵管无法卷曲，阴道膈出现隔断形成双子宫；Vangl2Lp/-杂合子50%出现阴道闭锁。另外，非经典Wnt/β-Catenin通路下游Pax8基因——一种在人和小鼠卵巢癌组织中高表达的配对盒基因，Pax8基因在细胞凋亡中也有重要作用，缺乏Pax8基因会导致小鼠先天性甲状腺功能减退， MITTAG J等[20]曾报道经人工敲除基因的Pax8-/-小鼠即使持续补充甲状腺素，雌鼠依然无法受孕，原因在于苗勒管在关键时期的发育停滞而不是激素失衡，这一研究表明[20]：苗勒管的分化障碍易导致雌鼠先天性上段阴道闭锁、子宫发育停滞、输卵管积水等先天性缺陷的发生。

3.2 PI3K-AKT相关信号通路Adamts18基因在PI3K-AKT和NF-κB信号通路的下游起作用。ATACA D等通过Cre/loxP重组酶系统基因打靶的方法构建了Adamts18基因敲除鼠造成转基因鼠出现晶状体外溢(100%发生)、肺塌陷、雌鼠阴道膈及阴道闭锁(50%发生)等病症。Adamts18基因编码的蛋白是具有解聚素和金属蛋白酶结构域及血小板反应蛋白基序的19个家族成员之一，也是锌依赖性分泌型金属蛋白酶，该酶与处理细胞外基质的成分，如纤维胶原，以及其他与硫酸软骨素蛋白聚糖的转化作用有关，小鼠体内缺少Adamts18造成发育异常的组织的胞外基质异常及构建细胞骨架蛋白障碍，最终导致青春期外阴及阴道重塑受损可导致阴道膈或阴道闭锁[17]。

Bcl-2家族蛋白Bcl-2、Bax、Bak、Bid、Bim、Puma等的作用基因不仅在PI3K-AKT信号通路的下游起作用，也在雌激素诱导的细胞凋亡中起作用，Bax和Bak基因同时敲除出现母鼠的子代大部分阴道闭锁，趾间网退化不全，造血障碍，中枢神经症状，仔鼠离乳期内不足10%成活等表型[18,23]。

3.3细胞凋亡及相关信号转导通路雌激素诱导的细胞凋亡被认为是青春期阴道开放的一种重要作用机制，通过转基因技术将人类BCL2基因转入C57BL/6J小鼠的基因组中，造成BCL2蛋白在阴道上皮细胞及黏膜细胞的过表达(其它组织经检测无表达)，促使了组织重塑过程中阴道口粘膜细胞的集体凋亡(其它组织细胞如耳廓、眼睑无此现象)，形成阴道末端闭锁，这与PI3K/AKT/ BCL2信号传导通路的作用且与瘢痕形成有相似之处[22]。BCL2家族的另两个成员Bax和Bak基因双敲除后也可使C57BL/6罹患阴道闭锁缺陷，90%以上的小鼠出生后离乳期内死亡，进一步研究发现Bax和Bak蛋白是通过启动线粒体凋亡最终导致细胞凋亡[18]。

2010年REN D等[23]报道了Bid、Bim和Puma三基因敲除小鼠出现了与Bax、Bak双基因敲除小鼠完全相同的临床表型，同时证明了这三个基因缺失后阻止了Bax蛋白的同种寡聚，导致细胞色素C介导的半胱天冬酶Caspase激活神经元和T淋巴细胞中的凋亡信号。P63是皮肤发育所需的P53(人与小鼠的抑癌基因)的同源基因，在成熟的鳞状上皮和宫颈的储备细胞中表达，美国病理学杂志曾报道[25]P63基因敲除小鼠胚胎期即形成无孔性阴道，表现为雌鼠苗勒管胚胎期即停止分化，胚胎期出现上段阴道闭锁；表明[24]在胚胎发育过程中阴道口的膜性封闭是P63依赖性转导信号缺失所诱导的先天性阴道闭锁，这一发现又提供了关于阴道闭锁P63所介导的细胞凋亡信号转导通路的研究思路。

前文所述的LHFPL2基因位于脂肪瘤高迁移率融合蛋白样HMGIC2蛋白相关的细胞凋亡P53家族蛋白类抑癌通路下游，LHFPL2基因G102E位点点突变的纯合子基因缺陷鼠子代会出现性激素抗性雌雄不育特征(包括100%雌性阴道闭锁和70%雄性不育)[10]。

3.4酪氨酸激酶受体信号通路Tyro3、Axl及Mer受体(TAM受体)是酪氨酸激酶受体亚家族之一，它们结构相似，有相同的Gas6和protein S配体，其二聚体结构使其胞内酪氨酸残基容易发生磷酸化，激活受体本身的酪氨酸蛋白激酶活性，催化下游分子信号转导，包括细胞增殖、迁移、黏附、吞噬作用参与生殖系统的调控，WU H等[11]研究认为TAM三联受体基因敲除鼠有较高概率的阴道闭锁发生率。

3.5 MAPK信号通路WU H等[11]曾报道，MAP3K1基因缺失小鼠突变系纯合子代雌鼠40%出现阴道闭锁和子宫积液，公鼠90%出现输精管堵塞睾丸萎缩的不育症。

总之，随着与实验小鼠阴道膈及阴道闭锁相关基因的陆续发现，与之相关联的蛋白和信号转导通路也逐渐清晰起来：例如，可以模仿人类MRKH综合征的苗勒管发育不良型阴道闭锁小鼠Pax8-/-[20]、P63-/-[24]与细胞凋亡信号通路密切相关；阴道子宫可以正常发育、表现有雌激素抗性的基因缺陷鼠β-CateninC429S+/C429S+的阴道闭锁与经典的Wnt/β-Catenin信号通路密切相关[9]；诱导雌鼠50%出现雌激素抗性阴道纵膈及阴道闭锁的Adamts18-/-小鼠与PI3K-AKT-Adamts18和NF-κB信号通路密切相关[17]。

4 问题与展望

虽然目前人类医学在有关阴道闭锁和阴道膈的妇产科、影像学、外科手术学等分支上有较深的造诣，在阴道闭锁和阴道膈致病基因的分子诊断水平上却研究的不够透彻，尚有不少隐性携带的基因需要进一步发现；不少罹患有阴道闭锁的少女也只能在月经初潮来临时感觉持续腹痛就诊时方检查发现自己患有此种疾病，疾病临床症状出现前被筛查发现的极少[18]。如何从分子层面认识、诊断、预防疾病，实现精准医疗是当前医学研究的大势所趋。小鼠生命周期短，饲养成本小，研究人员众多，投入有限的时间及科研成本可以观察数代的遗传信息；然而现有有关实验小鼠阴道膈及阴道闭锁的研究中极少关注如何利用人类医学先进的外科手术技术手段进行小鼠阴道口的人工修复[26-28]，以确保这些珍稀的小鼠品种能够恢复生育功能，扩大种群，为阴道膈及阴道闭锁小鼠的转录组学、基因组学和蛋白质组学等高通量深入探索提供更多研究材料。因此，为深入开展实验小鼠阴道膈及阴道闭锁的研究，实验动物研究人员不仅要熟练掌握现有的应用于小鼠阴道膈切除及阴道闭锁造口术的普外科技术手段，更应与时俱进引入激光治疗、显微外科、利用新型生物材料修补、人工智能手术等先进的技术手段，以保种繁育出更多的阴道膈及阴道闭锁小鼠个体，研究清楚这些雌性生殖缺陷，为人类精准医学研究服务。

综上所述，自发性阴道隔及阴道闭锁小鼠是揭开人类阴道隔及阴道闭锁分子生物学、遗传学的神秘面纱，建立和完善致病性基因数据库的良好研究材料。研究小鼠自发性阴道膈及阴道闭锁的形成机制，不仅可以为实验动物行业制定严格质控标准提供参照，而且可以指导实验动物繁育技术人员及时从生产力低下的淘汰小鼠中发现新的致病基因，保种并培育出新的突变品系，创造出更多应用于女性生殖缺陷研究的动物实验材料。