基于网络药理学的鸦胆子治疗食管癌的机制研究

王雅轩，李冰洁，崔抗，余朴，马望

郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

鸦胆子为苦木科（Simaroubaceae）鸦胆子属（Brucea J.F.Miller）植 物 鸦 胆 子 [Brucea javanica（Linnaeus）Merrill]的干燥成熟果实，又名老鸦胆、苦参子和鸦蛋子，主产于我国广东、广西、海南、云南、福建和台湾等地。鸦胆子化学成分非常复杂，其研究始于上世纪60年代初，迄今为止，已从鸦胆子种子和全草中分离鉴定了150多个化合物，其中主要包括苦木内脂类、黄酮类、蒽醌类、三萜类、甾体类、脂肪酸类、倍半萜类等化合物[1]。我国于1978年开始研制鸦胆子油静脉乳剂，并用于各种恶性肿瘤包括食管癌的治疗[2-4]。研究发现，鸦胆子油乳与其他抗癌药共用时，有一定的耐药逆转作用，可以增强其他药物对耐药细胞的细胞毒作用[5]。然而，鸦胆子抗食管癌的特定机制和有效单体尚不明确。本研究利用生物信息学和网络药理学，结合中药治疗疾病具有多成分、多靶点、多通路协同作用的特点，对鸦胆子治疗食管癌的靶点及作用机制进行了分析，为鸦胆子应用于食管癌临床提供理论依据，并为进一步的实验研究和临床应用提供思路。

1 材料与方法

1.1 鸦胆子有效成分及靶点的筛选

使用中药系统药理学数据库与分析平台（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）进行鸦胆子有效成分及靶点的筛选[6]。TCMSP是一种独特的中草药系统药理学平台，其包含了499味草药（中国药典2010版）以及每位草药的化合物成分（共计29000余个），并能捕捉药物、靶标和疾病之间的关系。在获得了有效成分以后，我们又以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%和类药性（druglikeness，DL）≥0.18为筛选条件[7]，对鸦胆子的活性成分进行进一步的筛选。

1.2 食管癌相关靶点的提取

利用 GeneCards数据库（https：//www.genecards.org/）和OMIM数据库（https：//www.omim.org/）进行食管癌相关靶点的提取。GeneCards是一个包含了150个网络来源的以基因为中心的数据的集成数据库，包括基因组、转录组学、蛋白质组学、遗传、临床和功能信息，提供所有有关注释和预测人类基因的全面信息。OMIM数据库中包含有关所有已知孟德尔疾病和超过15 000个基因的信息，其关注于表型和基因型之间的关系。我们把从两个数据库中获得的相关靶基因取并集，得到食管癌相关靶点。

1.3 “有效成分-靶点”网络图的构建

将鸦胆子有效成分的靶点和食管癌相关靶基因取交集，得到共同靶点基因。使用Cytoscape 3.7.1软件，利用所得到的交集基因做出“有效成分-靶点”网络图[8]。该网络图可以展示出鸦胆子有效成分和食管癌基因之间的关系。

1.4 靶蛋白相互作用网络（protein protein interaction network，PPI network）的构建

使用STRING数据库（https：//string-db.org/）构建靶蛋白的PPI网络。STRING数据库是一个搜索已知蛋白质和预测蛋白质之间相互作用的数据库，包括了直接的物理作用和简介的功能相关性。我们使用STRING数据库来观测靶基因蛋白之间的相互作用关系，并找出更为关键的核心基因。

1.5 富集分析

为了进一步的研究靶基因的分子机制，我们进行了基因本体论（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome，KEGG）分析。GO功能分析可以从功能、生物途径、细胞功能的角度对基因产物进行简单注释[9]。KEGG通路富集分析是一个整合了基因组、化学和系统功能信息的综合数据库，其中包含了基因的通路信息。其截断鉴定标准均为P＜0.05。

2 结果

2.1 鸦胆子成分及靶点筛选结果

通过使用TCMSP筛选出鸦胆子已知有效成分67种，通过OB≥30%、DL≥0.18条件进行筛选，获得15个符合条件的有效成分（表1），其对应40个靶基因。

2.2 食管癌靶基因的获取

我们在GeneCards和OMIM数据库中分别获取了与食管癌发生发展相关的基因靶点，取其交集，共有7 092个。

2.3 药物-疾病靶点预测结果

将44个鸦胆子有效成分靶基因和7 092个食管癌靶基因取交集，获得38个同时存与鸦胆子和食管癌相关的基因，对应了2种鸦胆子的有效成分，分别为木犀草素及β-谷固醇。我们使用Cytoscape 3.7.1软件构建鸦胆子与食管癌相关的“有效成分-靶点”网络图（图1）。

表1 鸦胆子主要成分基本信息Table 1 Basic information of main components of Brucea javanica

图1 鸦胆子与食管癌相关的“有效成分-靶点”网络图Figure 1 Network diagram of“active ingredientstargets”related to Brucea javanica and esophageal cancer

2.4 靶蛋白相互作用PPI网络分析

把我们获得的38个同时与鸦胆子和食管癌相关的靶基因利用STRING数据库构建PPI网络（图2）。图3展示的是靶基因蛋白之间的交互次数情况，其中次数越多，意味着靶基因在PPI网络中起到更加关键的作用。由图可知，PPI网络图中的核心 基 因 为 EGFR、 CASP3、 CCND1、 VEGFA、ERBB2、IL6。

图2 鸦胆子作用于食管癌的PPI网络图Figure 2 PPI network diagram of Brucea javanica acting on esophageal cancer

图3 靶基因蛋白交互情况图Figure 3 Target gene protein interaction diagram

2.5 GO功能分析

我们利用R软件，对38个鸦胆子和食管癌的交集靶基因进行了GO功能分析。共富集到了55个功能（P＜0.05），按P值从小到大排序前20个功能的情况见表2、图4。图表结果显示，鸦胆子化合物主要富集的功能包括：泛素样蛋白连接酶结合、蛋白质异二聚活性、神经递质受体活性、泛素蛋白连接酶结合、乙酰胆碱受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性、G蛋白偶联的胺受体活性、核受体活性、转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合、蛋白磷酸酶结合、BH域绑定、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型肽酶活性染色质结合、磷酸酶结合、死亡受体结合、内肽酶活性、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性、激素结合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性。

2.6 KEGG通路富集分析

我们对38个基因做了KEGG通路富集分析，结果显示富集到了98条通路上（P＜0.05）。按P值从大到小排序前20条通路的情况见表3、图5。图表结果显示，鸦胆子化合物主要富集的通路包括：前列腺癌、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、EB病毒感染、铂耐药、PI3K-Akt信号通路、凋亡-多种类、军团菌病、细胞凋亡、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGERAGE信号通路、膀胱癌、p53信号通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小细胞肺癌、丙型肝炎、非小细胞肺癌、HIF-1信号通路。

3 讨论

《本草纲目拾遗》中记载“鸦胆子，出闽、广，药肆中皆有之。形如梧子，其仁多油，生食令人吐，作霜，捶去油，入药佳”，并提出鸦胆子具有清热解毒、截疟、止痢、腐蚀赘疣的功效[10]。在现代医学中，鸦胆子也被广泛应用，尤其在抗肿瘤领域。其提取物鸦胆子油乳具有抗癌谱广、毒性低、效果好等诸多优点，且已广泛用于多癌种的研究及治疗[11]。在一项鸦胆子油乳注射液对晚期肝癌患者的临床疗效研究中显示，其在晚期肝癌的治疗方面发挥重要作用，具有应用前景和研究价值[12]。在食管癌的治疗方面，有研究表明在食管癌同步放化疗的过程中联合运用鸦胆子油乳注射液，可减轻放化疗治疗的毒副反应，提高患者的生存质量[4]。

表2 鸦胆子治疗食管癌的关键靶点功能信息Table 2 Key target function information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

图4 GO功能分析柱状图Figure 4 GO function analysis histogram

表3 鸦胆子治疗食管癌的关键靶点富集通路信息Table 3 Key target enrichment pathway information of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

图5 鸦胆子治疗食管癌的关键通路Figure 5 Key pathways of Brucea javanica in the treatment of esophageal cancer

表皮生长因子受体（pidermal growth factor receptor，EGFR）为表皮生长因子受体，属于受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTKs）的酪氨酸激酶受体（ErbB）家族，在细胞生理过程中发挥重要的调节作用，它常在癌症发生时突变或过表达，目前也为多种抗癌药物的靶点基因之一[13-15]。半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3，CASP3）激活在细胞凋亡的执行阶段起着核心作用，其突变与多种癌症的发生有关[16]。细胞周期蛋白D1（Cyclin D1，CCND1）的蛋白产物可以调节细胞周期，其突变、扩增和过表达可促进肿瘤的发生[17]。血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的上调可促进肿瘤组织的血管生成，也可以影响肿瘤微环境中免疫细胞的功能[18]。已有研究表明，酪氨酸激酶受体2（ERBB2）的扩增存在于15%～17%的食管癌中，其激活与食管癌的转移有关[19]。白细胞介素-6（Interleukin-6，IL6）是由多种类型的细胞产生的具有多种生物学功能的细胞因子，其与炎性疾病及肿瘤细胞的增殖有关，大量数据显示其抑制剂可以治疗炎性疾病及抑制癌细胞增殖[20]。我们猜测鸦胆子通过其含有的有效成分木犀草素及β-谷固醇，来调节EGFR、CASP3、CCND1、VEGFA、ERBB2、IL6等靶点的表达或抑制其突变，从而达到抑制食管癌生长的作用。这也表明了鸦胆子通过多成分、多靶点的作用特点治疗食管癌。

鸦胆子活性成分与食管癌交集的靶基因的GO功能富集分析结果主要包括泛素样蛋白连接酶结合、蛋白质异二聚活性、神经递质受体活性、泛素蛋白连接酶结合、乙酰胆碱受体活性、半胱氨酸型内肽酶活性、G蛋白偶联的胺受体活性、核受体活性、转录因子活性，直接的配体调节序列特异性DNA结合、蛋白磷酸酶结合、BH域绑定、类固醇激素受体活性、半胱氨酸型肽酶活性染色质结合、磷酸酶结合、死亡受体结合、内肽酶活性、细胞周期蛋白依赖性蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶调节剂活性、激素结合、磷脂酰肌醇磷脂酶C活性等。

在KEGG通路富集分析中发现，鸦胆子治疗食管癌的主要通路有前列腺癌、乙型肝炎、人巨细胞病毒感染、EB病毒感染、铂耐药、PI3K-Akt信号通路、凋亡-多种类、军团菌病、细胞凋亡、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、膀胱癌、p53信号通路、胰腺癌、甲型流感、麻疹、小细胞肺癌、丙型肝炎、非小细胞肺癌、HIF-1信号通路。其中，PI3K-Akt信号通路在调节细胞存活、生长、增殖、血管生成、转录、翻译和代谢中起着至关重要的作用[21]，可以调节食管癌的发生与发展。p53信号通路在调控细胞周期、细胞凋亡表达等方面发挥着重要作用[22]，有研究表明通过调节p53信号通路可以抑制食管癌细胞增殖并诱导细胞周期G0/G1时期停滞[23]。HIF-1信号通路可由肿瘤内缺氧的激活，其过表达与包括食管癌在内的肿瘤转移和较差的预后密切相关[24，25]。由通路富集分析可知，鸦胆子有效成分靶基因富集到的通路主要通过调节肿瘤细胞周期、细胞凋亡、肿瘤内血管生成来影响食管癌的发生发展及预后。

本文基于网络药理学及生物信息学，研究了鸦胆子治疗食管癌的作用机制。我们通过PPI网络分析聚焦核心基因，通过富集分析进一步分析其作用机制。研究发现，中药鸦胆子对食管癌的治疗可通过多种有效成分及与食管癌相关靶基因和通路产生作用。本研究仍存在一些不足，如数据均从公开数据库获取，可能会存在内容更新不及时及数据筛选不准确的缺点。本研究结论还需临床及实验结果验证。