白藜芦醇联用紫杉醇对食管癌EC109细胞凋亡的影响

2020-07-29刘晓洁李永梅霍峻锋赵劲竹董亚龙周凯瑞张雪燕李蕾蕾王淙

中医肿瘤学杂志 2020年3期

刘晓洁，李永梅，霍峻锋，赵劲竹，董亚龙，周凯瑞，张雪燕，李蕾蕾，王淙

1.郑州大学药物研究院，河南郑州 450001；2.滨州医学院烟台附属医院，山东烟台 264000；3.河南省新乡市第二人民医院，河南新乡 453000

食管癌是一种消化道恶性肿瘤，其恶性程度高，在全球范围内恶性肿瘤死亡人数中排第六位[1]。多数患者在确诊时就已经是晚期，食管癌的五年生存率不足30%[2]。目前，化疗是食管癌的主要治疗手段之一。

紫杉醇（Paclitaxel，PTX）具有广泛的抗肿瘤活性，对卵巢癌，乳腺癌，前列腺癌和食管癌等恶性肿瘤的早期治疗具有一定的效果[3，4]。临床常用PTX治疗食管癌，但其具有较强的毒副作用并易产生耐药性。因此，联合用药成为近年来研究的热点。但联合用药也可能会产生一定的拮抗作用。研究发现，在某些恶性肿瘤中，白藜芦醇联用紫杉醇具有协同作用[5，6]。白藜芦醇（Resveratrol，Res）在结构上类似于二苯乙烯，是一种多酚类植物抗毒素，存在于多种植物和草药中，如葡萄、蓝莓、桑葚、花生、虎杖等[7]。其具有多种药理学和生理学活性，包括抑制肿瘤、心血管保护作用、减少血小板凝集以及化学预防作用[8-11]。目前，有部分临床医生鼓励患者服用含有白藜芦醇的膳食补充剂或食物以提高整体的药物疗效。在临床治疗中，许多天然化合物与药物同时使用后，可以改变药物外排转运体特性从而影响药代动力学。本课题主要探究白藜芦醇对紫杉醇抗肿瘤作用的影响，以期为临床应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 细胞以及主要试剂

PTX和Res购自海南康力制药有限公司。二甲基亚砜（DMSO）和核糖核酸酶购自索莱宝（中国北京）。溴化噻唑蓝四氮唑（MTT），罗丹明123（Rh123）和碘化丙啶（PI）购自Sigama（美国密苏里州圣路易斯市）。Hoechst 33258（双苯酰亚胺）购自碧云天公司。食管癌EC109细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 细胞培养

将EC109细胞转移至含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基的培养皿中后，置于37℃，5%CO2的培养箱中培养。2～3 d进行一次传代，隔天更换一次培养基以供给细胞营养，取对数生长期细胞用于后续实验。

1.3 使用MTT法检测各个用药组的细胞活力

将EC109细胞接种于96孔板中，孵育过夜。将不含药物的培养基加入对照孔中，用PTX和Res单独使用以及不同浓度的PTX和Res组合处理细胞48 h，然后每孔加入20 μlMTT。4 h后吸去96孔板中的溶液，每孔加入150 μLDMSO。摇床上震荡10 min。使用酶标仪在490 nm处读取每孔的吸光度。

1.4 结晶紫染色检测细胞的克隆形成能力

将EC109细胞接种于6孔板中每孔铺1 000个细胞。隔夜培养后，使用不同组别的药物处理6孔板中的细胞48 h。弃去含药物的培养基并加入全新培养基。然后将细胞培养7天，期间隔天换液。7天后弃去旧培养基，PBS洗2次，加1 mL甲醇固定30 min，弃去固定液，PBS洗2次，每孔加入2 mL 1%结晶紫染液，染色30 min。弃去染液，PBS洗3次。室温自然晾干。Image J计数细胞集落。相机拍摄集落图像。实验独立重复三次。

1.5 Hoechst 33258染色法检测细胞核的变化情况

将细胞接种在提前放入无菌玻璃片的6孔板中，隔夜培养后，使用不同组别的药物处理24 h。药物处理后，弃去药液，用4%多聚甲醛固定15 min，PBS清洗6孔板，Hoechst 33258避光染色30 min。PBS洗2次，充分洗去多余染料，小心取出玻璃片，盖在盖破片上，用滤纸吸走周边残余液体，荧光显微镜观察拍照。实验独立重复三次。

1.6 流式细胞仪检测细胞凋亡

通过流式细胞仪用AnnexinV-FITC/PI染色试剂盒分析细胞凋亡。将EC109细胞接种在6孔板中贴壁，并用药物处理细胞24 h。收集细胞，PBS洗2次，加入Binding Buffer，然后加入1 μL Annexin V-FITC染液，避光染色10 min，每组样品加入PI染色液1 μL，避光染色5 min。加入适量PBS调节细胞浓，涡旋，处理完样品后使用流式细胞仪检测每组样品中细胞凋亡百分比。实验重复三次。

1.7 罗丹明123（Rh123）外排实验检测细胞内Rh123蓄积情况

将EC109细胞接种于6孔板中，孵育过夜。药物处理后继续孵育24 h。随后，加入用新鲜培养基配制的1 μg/mL Rh123溶液，在细胞培养箱中孵育30 min。收集细胞，PBS洗两次。流式细胞仪分析细胞内罗丹明荧光强度。

1.8 HPLC检测细胞内PTX含量

取对数生长期的细胞接种于6孔板中。根据药物的添加剂量分为四组：空白对照，PTX单用组（1，3 μg/mL PTX）、Res单用组（25 μM Res）、联用组（1 μg/mL PTX+25 μM Res，3 μg/mL PTX+25 μM Res）。用不同组别的药物处理细胞2 h，收集细胞，然后用PBS洗涤，离心并重悬在1 mL PBS中。用细胞破碎器破碎细胞。每管样品加6 mL乙酸乙酯沉淀，涡旋5 min。4950 rpm，4℃，离心15 min。取上清5 mL，用氮气吹扫仪吹干。将每个样品重新溶解在100 μL甲醇溶液中，并在4℃下以11 500 rpm离心细胞15 min，然后通过HPLC进行检测。随后，用70 μL上清液用于定量分析。使用Agilent 1200 HPLC系统，分析样品，所述系统包括四元泵，自动进样器和UV检测器。使用Kromasil C18色谱柱（150×4.6 mm，5 μm，Diamonsil）进行分离。流速为1.0 mL/min；流动相：甲醇∶乙腈∶水=35∶56∶39；检测波长227 nm，柱温30℃，进样量20 μL。

1.9 统计方法

每项实验重复三次。SPSS 21.0进行统计学分析，采用方差分析对数据进行比较。P＜0.05表示有统计学差异。

2 结果

2.1 Res降低PTX在EC109细胞中的细胞毒作用

为了测量Res和PTX单用和联合用药的细胞毒性，用不同浓度的PTX（10，30，60和120 nmol/L），Res（5，10和25 μmol/L）处理EC 109细胞48 h。结果如表1及图1所示。PTX在浓度为10、30、60和120 nmol/L时可显著抑制EC109细胞的增殖，且具有浓度依赖性。与单用PTX相比，三种不同浓度的Res对EC109细胞增殖均没有明显的抑制作用。然而，PTX在联用Res时，Res显著减弱了PTX对EC109细胞的细胞毒作用。通过CompuSyn软件和Chou-Talalay方法对Res和PTX的联用指数（CI）进行评估[12]，CI＜1表示协同作用，CI＞1表示拮抗作用，CI=1表示加和作用。实验结果显示，不同组合浓度中，Res联用PTX的CI值均大于1，如图2所示。根据实验结果，我们选择25 μM Res联用60 nM PTX用于后期研究。

2.2 细胞形态学改变

为了观察药物处理引起的形态变化，在PTX浓度为60 nM，Res浓度为25 μM时，以不同组合对EC109细胞进行处理。结果如图3所示。空白对照组中EC109细胞粘附状态及生长状态良好，具有清晰的边界和不规则形状。用25 μMRes处理后，EC109细胞的细胞状态和形状与空白对照组相比没有显著变化。当用60 nM PTX处理时，细胞变圆，体积减小，细胞漂浮，大多数细胞经历了类似于细胞凋亡的形态学改变。当用PTX和Res同时处理细胞时，细胞形态又趋于正常，细胞数显著增加，细胞碎片减少。

表1 PTX与Res联用对EC109细胞细胞活力的影响（%）（n=3）Table 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability（%）（n=3）

图1 PTX与Res联用对EC109细胞细胞活力的影响Figure 1 Effect of PTX combined with Res on EC109 cell viability

图2 不同药物处理组中的联合用药指数Figure 2 Combination index in different drug treatment groups

图3 不同药物处理组的细胞形态（200×）Figure 3 Cell morphology in different drug treatment groups（200×）

2.3 Res减少PTX诱导的细胞凋亡

以上结果表明，Res显著削弱了PTX在EC109细胞中的细胞毒性。克隆形成实验结果显示，PTX处理过的组别中，几乎没有观察到细胞克隆所形成的集落，克隆形成率为（10.81±1.24%）。当用Res联合PTX处理细胞时，EC109的克隆形成能力相较于单独使用PTX处理时显著增强，且克隆形成率增加至（18.81±2.91%），见表2。

表2 不同药物处理组中的克隆形成率Table 2 Colony formation ratein different drug treatment groups

通过Hoechst 33258染色和流式细胞术来检测EC109细胞的凋亡。Hoechst 33258染色用于观察形态学变化，Annexin V和PI染色用于研究细胞凋亡率。不同药物处理组的EC109细胞用Hoechst 33258染色并在荧光显微镜下观察，结果如图4所示。在空白对照组中观察到细胞核中的蓝色荧光较为均匀。用60nM PTX处理后，观察到细胞核碎裂和明显的凋亡小体。在25 μM Res处理组中，只有少数细胞表现出核染色质凝聚和凋亡小体。然而，在用60 nM PTX与25 μM Res联用处理后，与单用PTX处理组相比，凋亡细胞的数量显著降低。

图4 不同药物处理组中细胞凋亡相关的形态学变化（200×）Figure 4 Morphological changes related to apoptosis in different drug treatment groups（200×）

Annexin V/PI凋亡试剂盒用于检测流式细胞仪检测细胞凋亡百分比，如表3及图5所示。在EC109细胞中，单用60 nM PTX组可引起细胞凋亡，凋亡率为（39.8±5.67%）。单用25 μM Res组中凋亡率为（14.1±2.53%）。然而与单用PTX对比，联合Res用药组的细胞凋亡率明显下降，凋亡率为（22±3.99%）。这些结果表明，在一定浓度下，Res可拮抗PTX诱导的细胞凋亡作用。

2.4 Res与PTX联用可增强P-gp活性

Rh123是一种黄绿色荧光染料，是P-gp跨膜蛋白的特异性底物，在低浓度下无细胞毒性[13]。若P-gp的转运能力增强，Rh123的摄取将减少，细胞中的平均荧光强度将降低。使用FlowJo 7.6软件分析数据。细胞内积累的荧光强度显示，与单用PTX相比，组合组中平均荧光强度降低2.02倍。P-gp可介导Rh123积累量的变化。结果表明，Res与PTX联用时通过增强P-gp活性降低了EC109细胞中的PTX积累。实验结果如表4所示。

2.5 Res减少细胞内PTX的积累

通过HPLC检测不同用药组中细胞内PTX的积累浓度。结果如表5和图6所示。短箭头标识的为PTX的吸收峰，保留时间为6.99 min。利用所用的色谱条件，可以分离细胞内的PTX和内源性物质，没有杂质干扰。1 μg/mL和3 μg/mL PTX与25 μM Res联用组均比PTX单用组细胞内PTX的含量低。结果表明，Res减少了EC190细胞中PTX的积累。

表3 不同药物处理组中的细胞凋亡率Table 3 Apoptosis rate in different drug treatment groups

3 讨论

图5 不同药物处理组细胞凋亡结果Figure 5 Apoptosis results of different drug treatment groups

表4 不同药物处理组的细胞平均荧光强度Table 4 Average fluorescence intensity of cells in different drug treatment groups

食管癌是一种常见的消化系统恶性肿瘤，其治疗方案较多，在很多情况下药物联用的治疗方案是有效的，但也存在药物之间的拮抗作用。值得注意的是，本研究结果显示，PTX和Res之间的相互作用降低了PTX抑制食管癌的疗效。通过HPLC实验，我们发现Res可降低PTX在细胞内的蓄积，但是Res拮抗PTX的更深入的作用机制有待进一步研究。

来自蔬菜和水果的天然化合物通常被认为是安全的，很多研究也表明其可降低患癌风险。因此，合理的膳食补充剂、中草药可与处方药物同时使用。Res作为恶性肿瘤患者膳食的佐剂，可能与药物具有相互作用。此外，还要考虑来自食物中Res在体内的吸收、分布、代谢和排泄特性，才能确定恶性肿瘤患者在使用PTX时能否能同时补充Res。然而，药物与植物化学物质之间相互作用的研究太少。食物成分对P-gp等药物转运蛋白功能的影响尚未得到广泛研究[14]。有研究在膀胱癌、乳腺癌等恶性肿瘤中观察到Res和PTX联用会抑制PTX的抗肿瘤作用，且在乳腺癌的研究中，通过动物体内实验证实了Res联用PTX会降低PTX诱导的细胞凋亡作用[15，16]。基于上述研究，食管癌患者在使用PTX治疗期间，食用含有Res的食物似有降低PTX药效的风险，然而这一理论在未来仍需体内和临床的进一步验证。