基于网络药理学探讨通幽汤治疗食管癌的作用机制

孙亚云 ，王若凡 ，张娟

1.河南中医药大学，河南 郑州 450046；2.河南省中医院，河南 郑州 450002

2018年全球癌症统计数据显示：食管癌是世界范围内第七大恶性肿瘤，居癌症相关死亡原因第六位[1]。食管癌是我国第六大恶性肿瘤，居癌症相关死亡原因第四位[2]。最新发布的2020年消化系统癌症预估新发病例及死亡病例中，食管癌分别位于第六位、第四位[3]。西医治疗食管癌主要是通过手术、放疗、化疗、介入等方式，中医则主要通过口服中药汤剂达到治疗效果。食管癌属于中医“噎膈”、“噎塞”等范畴。多数食管癌患者在发病早、中期已有血瘀表现，部分患者的血瘀症状则贯穿于发病始终。通幽汤作为活血通幽的经典代表方剂，临床上应用广泛。目前，针对通幽汤，无论是临床观察还是实验研究，都尚未明确指出其有效活性成分、体内作用靶点和作用机制。食管癌的高发病率、高死亡率及通幽汤治疗食管癌的有效性都要求我们应进一步探索通幽汤治疗食管癌的作用机理。

近年来，网络药理学平台的系统、完整构建，为我们寻求通幽汤治疗食管癌的作用机理提供了契机。网络药理学适用于中药多成分、多靶点、多通路特点，对药物、基因和疾病的相互作用网络进行分析，了解中药及其复方的作用机制，全面深入探究中药与机体的相互作用关系[4]。本研究借助网络药理学平台探讨通幽汤治疗食管癌的主要成分、作用靶点及信号通路，为该方的临床应用及进一步的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究使用软件及在线工具

本研究使用的软件见表1。

1.2 通幽汤有效成分筛选

本研究借助TCMSP数据库[5]、TCMID数据库[6]、Batman-TCM数据库[7]结合文献查找对通幽汤中药味桃仁、红花、生地黄、熟地黄、当归、升麻、甘草、槟榔进行化学成分检索。依据药代动力学参数（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%[8]、类药性（DL）≥0.18[9]为条件进行筛选。

1.3 通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络构建与分析

将收集得到的化学成分输入TCMSP数据库获得化合物的预测蛋白靶点，利用UniProt数据库[10]中UniProKBt的检索功能将所有靶点名称校正为官方名称，建立“药物-成分-靶点”数据信息库。使用cytoscape3.7.2软件进行网络结构可视化处理，构建通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络并根据度值筛选活性成分。

表1 本次研究使用软件及在线工具Table 1 Software and online tools were used in this study

1.4 食管癌相关靶点筛选

本研究借助genecards数据库[11]，以“esophageal carcinoma”或“esophageal cancer”为关键词，对食管癌相关靶点进行收集并结合OMIM[12]、TTD[13]、DRUGBANK[14]数据库补充相关靶点。根据经验，若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为食管癌的潜在靶点。将以上4个疾病数据库检索结果合并，去除重复值，作为食管癌的预测靶点库。

1.5 “药物-疾病”靶点映射

通过FUNRICH 3.1.3软件“Add dataset”功能将药物有效活性成分对应靶点导入并命名为“成分靶点”，食管癌相关靶点导入并命名为“疾病靶点”，通过“Venn”功能进行映射，获得通幽汤治疗食管癌的潜在作用靶点，绘制韦恩图。

1.6 共有靶点PPI网络构建与分析

将“药物-疾病”共有靶点导入在线STRING平台，限定研究物种为“Homo sapiens”、“minimum required interaction score（≥0.9）”并且隐藏网络中断开的节点，其他参数保持默认设置，得到蛋白与蛋白相互作用信息，构建PPI网络图。在“Exports”下保存其TSV格式文件，将文件中的node1，node2，combined score信息导入Cytoscape 3.7.2软件绘制蛋白相互作用网络后，进一步进行网络拓扑结构分析。节点表示靶点，边表示蛋白与蛋白之间相互作用，combined score值反映边的粗细，节点degree值反映靶点大小及颜色深浅。Combined score值由小到大，则边由细到粗。Degree值由小到大，则节点由小到大，颜色由浅至深。同时采用MCODE算法进行潜在蛋白质功能模块分析，将K-Core设置2，将结果显示score大于2的模块根据打分进行聚类排序。

1.7 GO富集分析和KEGG通路富集分析

Metascape平台拥有全面的注释功能并且每月更新基因注释的数据资料[15]。将130个“药物-疾病”共有靶点录入Metascape平台进行GO富集分析和KEGG通路富集分析。限定“Min Overlap：3”、“P Value Cutoff：0.01”、“Min Enrichment：1.5”。其中GO富集分析包括分子功能（Molecular function，MF），细胞组分（Cellular component，CC）和生物过程（Biological process，BP）三个部分。查阅相关资料，对所得到的涉及靶点较多的通路进行分析。借助EasyChar平台对结果进行可视化。

1.8 “通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络的构建与分析

将Metascape平台KEGG通路富集分析得到的前20条KEGG通路与通幽汤活性成分及靶点信息按照网络文件和属性文件进行excel文件格式的数据编排，上传至Cytoscape 3.7.2软件，构建“通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络图。运用CytoScape 3.7.2内置的“NetworkAnalyzer”工具分析成分、靶点、通路的网络拓扑参数，包括连接度（Degree）、 介 度（Betweenness）、 紧 密 度（Closenesss）等，并根据网络拓扑学参数判断核心靶点及发挥药效的主要活性成分。

1.9 核心基因预后分析与差异验证

Kaplan Meie-plotter是一种常用的基于EGA、TCGA和GEO数据库的在线网站工具，用于评估基因对生存期的影响[16]。设定癌种为“Esophageal Adenocarcinoma、 Esophageal Squamous Cell Carcinoma”，选取“通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络中靶点Degree值高于平均靶点Degree值的靶基因。将所得基因依次通过KM-plotter进行生存分析。筛选出对食管癌总生存期（Overall Survival，OS）有影响的基因，将p值＜0.05的基因进一步在GEPIA网站进行差异验证。

2 结果

2.1 通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络构建与分析

从TCMSP、TCMID、Batman-TCM数据库及文献中共获取通幽汤8味药161个活性成分，并查询通幽汤化合物对应的靶标蛋白，利用UniProt数据库将所有靶点名称校正为官方名称，删除重复项后共预测靶标251个。方中各药味活性成分和预测靶标数量见表2。使用Cytoscape 3.7.2软件进行网络结构可视化处理，构建通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络，如图1。通过CytoScape 3.7.2内置的“Network Analyzer”进行网络拓扑分析，根据度值筛选活性成分，度值排前10位的代表成分见表3。

2.2 食管癌相关靶点筛选

以“esophagealcarcinoma”为关键词在genecards数据库获取疾病靶点6 107个，以“esophageal cancer”为关键词在genecards数据库获取疾病靶点7055个。根据经验若靶点过多则设定Score大于中位数的目标靶点为食管癌的潜在靶点。如genecards中“esophageal carcinoma”Score最大值为154.61，最小值为0.2，中位数为2.54，则设定Score＞2.54的靶点为食管癌的潜在靶点。结合OMIM、TTD、DRUGBANK数据库补充相关靶点，合并4个数据库后删除重复值，最终得到1 378个食管癌相关靶点。

表2 通幽汤“中药-成分-靶标”基本信息Table 2 Basic information of common targets of Tongyou Decoction

表3 通幽汤的核心活性成分Table 3 Core active ingredients of Tongyou Decoction

图1 通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络Figure 1 Network of Chinese medicine-active ingredients-prediction target of Tongyou Decoction

2.3 共有靶点PPI网络构建与分析

通过FUNRICH3.1.3软件“Add dataset”功能将成分靶点与疾病靶点经“Venn”功能进行映射，获得通幽汤成分-食管癌共同靶点130个，如图2。进而将靶点提交至String数据库，获得STRING平台共有靶点蛋白相互作用信息，如图3-A。保存其TSV格式文件，将文件中的node1，node2，combined score信息导入Cytoscape3.7.2软件绘制蛋白相互作用（PPI）网络，如图3-B。进一步进行网络拓扑结构分析，如图3-C。该网络共涉及125个节点，668条边，网络平均邻居节点数为：10.688。共有48个靶蛋白Degree值高于平均值，其中AKT1、STAT3、TP53、JUN、MAPK1、MAPK3等靶点蛋白Degree值较大，表明与其他蛋白相互作用较强，因此这些蛋白在网络中具有重要作用。同时采用MCODE算法进行潜在蛋白质功能模块分析，将K-Core设置2，结果显示score大于2的模块根据打分的排序聚成7类，分析得到AKT1、TP53、BCL2、CCNB1等58个基因。筛选结果见图3-D。

图2 活性成分靶点与食管癌靶点venn图Figure 2 Venn diagram of active component target and esophageal cancer target

2.4 GO富集分析及KEGG通路富集分析

将130个关键靶蛋白导入Metascape数据库进行GO富集分析及KEGG通路富集分析，借助EasyChar平台对结果进行可视化。其中生物过程（BP）涉及对无机物的反应、对有毒物质的反应、细胞对有机环化合物的反应、脂质细胞反应、细胞死亡的正向调节等；细胞组成（CC）涉及细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶全酶复合物、膜筏、转录因子复合体、囊泡腔等；分子功能（MF）涉及蛋白激酶结合、转录因子结合、蛋白质均二聚活性、蛋白质结构域特异性结合、蛋白激酶活性等。KEGG通路富集分析涉及癌症通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、前列腺癌、流体剪切应力与动脉粥样硬化、弓形虫病、丙型肝炎、p53信号通路、FoxO信号通路、癌症中的转录失调、NF-κB信号通路、化学致癌作用等。根据p值排序，每个模块前10位的条目见图4A-D。

图3 PPI筛选网络图Figure 3 PPI screening network diagram

2.5 “通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络的构建与分析

图4 GO富集分析及KEGG通路富集分析Figure 4 GO enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis

运用CytoScape3.7.2构建“通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络，如图5。网络共涉及237个节点和1 322条边。通过CytoScape 3.7.2内置的“NetworkAnalyzer”功能分析通幽汤治疗食管癌的网络拓扑学参数，并根据Degree值筛选通幽汤治疗食管癌的关键成分及核心作用靶点。Cytoscape网络分析表明，槲皮素连接度（Degree）为148，介度（BetweennessCentrality）为 0.2 097 949，紧密度（ClosenessCentrality）为0.55 269 321，预测槲皮素为通幽汤治疗食管癌的主要成分。其次为山柰酚（连接度为52，介度为0.03 152 119，紧密度为0.45 124 283）、木犀草素（连接度为38，介度为0.05 169 843，紧密度为0.47 294 589）、β-谷甾醇（连接度为33，介度为0.00 784 141，紧密度为0.42 369 838）。按度值排列前10位见表4。

PTGS2在网络中的连接度为126，介度为0.31 799 445，紧密度为0.63 101 604，预测PTGS2为通幽汤治疗食管癌的最主要靶点。HSP90AA1、PPARG、AR、NOS2、CDK2、GSK3B、MAPK14亦为相对重要靶点。根据p值进行排序，靶标通路富集结果前10位见表5。

2.6 核心基因预后分析与差异验证结果

选取“通幽汤成分-食管癌靶点-通路”网络中靶点Degree值高于平均Degree值的靶点共17个，进一步使用KM-plotter分析核心基因的预后信息，其中HSP90AA1、CDK2、AKT1、JUN与食管腺癌总生存期相关（P＜0.05），GSK3B、CHEK1、BCL2与食管鳞癌总生存期相关（P＜0.05），如图6所示。进一步在GEPIA在线数据库对以上7个基因进行食管癌癌组织与癌旁组织的差异表达验证，结果显示HSP90AA1、GSK3B、CHEK1基因在食管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织（p＜0.05，红色代表肿瘤组织，灰色代表癌旁组织），如图7所示。

图5 通幽汤成分-食管癌靶点-通路网络图Figure 5 Tongyou Decoction composition-esophageal cancer target-pathway network

3 讨论

通幽汤出自《兰室秘藏》卷下，由桃仁、红花、生地黄、熟地黄、当归、升麻、甘草、槟榔8味药配伍而成。本方主治瘀血内停，血燥津枯，幽门不通之证，具有养血活血，润燥通幽的功效。现代临床研究表明，通幽汤或通幽汤联合放化疗、放射性125I粒子植入、中成药等治疗食管癌均能起到较好疗效[17-21]。通幽汤“中药-活性成分-预测靶点”网络显示：一味中药可对应多个化合物，同一化合物可调控不同靶点，显示了通幽汤发挥作用是通过多成分、多靶点的协同作用。

表4 通幽汤治疗食管癌的核心活性成分Table 4 The core active ingredients of Tongyou Decoction in the treatment of esophageal cancer

表5 靶标通路富集结果Table 5 Enrichment results of target pathway

通幽汤治疗食管癌的药味及活性成分筛选：①药味：前10位通幽汤治疗食管癌的核心活性成分所对应的17个药味中，红花占7味，占比约41%。活性成分最高的槲皮素所对应的药味亦为红花。故初步推测红花可能为通幽汤治疗食管癌的关键药味。临床研究表明红花提取物红花黄色素可有效降低胸腔镜食管癌根治术术后患者早期并发症，减弱机体创伤的氧化应激反应，改善肺功能，提高临床治疗有效率[22]。②活性成分：根据Degree值进行排序，槲皮素连接度最高，预测槲皮素为通幽汤治疗食管癌的主要成分。其次为山柰酚、木犀草素、β-谷甾醇等，这与通幽汤预测的核心活性成分具有一致性。食管癌相关基础研究表明，槲皮素可抑制人食管癌Eca109细胞的增殖、迁移、侵袭及血管新生，又可诱导人食管癌Eca109细胞发生保护性自噬、促进其凋亡，呈时间和剂量依赖效应[23-25]。山柰酚通过靶向EGFR信号通路抑制食管鳞状细胞癌的细胞增殖和糖酵解[26]。木犀草素可能通过诱导Eca109细胞凋亡，参与caspase3、caspase9 mRNA和蛋白的表达，从而起到促进细胞凋亡的作用[27]。

图6 KM-plotter分析Figure 6 KM-plotter analysis

图7 GEPIA分析Figure 7 GEPIA analysis

通幽汤治疗食管癌的靶点主要集中在PTGS2，HSP90AA1亦为重要靶点之一。临床研究表明前列腺素过氧化物酶-2（PTGS2）的酶活性与炎症和肿瘤生长相关，是一种潜在的预后生物标志物[28]。尽管使用KM-plotter对PTGS2进行基因预后信息分析显示：PTGS2与食管癌生存期无统计学意义，但回顾既往研究，PTGS2与食管癌的研究多集中在生存期方面，结论尚不相同，目前有：PTGS2的表达与食管癌的生存期无关[29]、PTGS2高表达不利于食管癌患者的生存[30]、PTGS2高表达与提高总体生存率和癌特异性生存率相关[31]等，故PTGS2能否作为食管癌预后性生物标志物仍是未来需进一步研究的方向。HSP90AA1与食管癌侵袭转移相关，HSP90AA1下调表达使CE81T-4细胞周期阻滞于G0/G1期，促进凋亡，抑制增殖、侵袭和迁移能力[32]。KM-plotter分析亦显示HSP90AA1与食管癌总生存期相关，并且HSP90AA1在食管癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。

PPI网络共涉及125个关键靶点，48个靶点Degree值高于平均值。使用MCODE算法，根据Cluster score值聚类排序进行潜在蛋白质功能模块分析，score值最高的模块涉及14个靶点，是最具有生物学意义的集合。该集合有2种含义，一为蛋白质复合体，即多个蛋白质共同组成复合体而后发挥生物学作用；二为功能模块，即位于同一通路的蛋白质，其相互作用更加密切[33]。PPI网络亦表明通幽汤多靶点治疗食管癌的特点。

通幽汤治疗食管癌的通路主要集中在癌症通路（hsa05200）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路（hsa04933）、前列腺癌（hsa05215）等。钟珊等[34]研究发现ESCC组织/细胞中显著降低的miR-3914和miR-8082与癌症通路相关，其余两者与食管癌尚无相关研究。就中医病因病机而言，食管癌、糖尿病、前列腺癌病机均有阴虚血瘀表现，治疗上均可使用通幽汤[35-37]进行治疗，这充分体现了中医辨证论治、异病同治的治疗原则。就经络循行而言，前列腺癌、食管癌皆为足厥阴肝经所循行，糖尿病则符合中医“络病”表现，络脉亦可与肝经相连，故三者经络循行相关。后续研究中可否通过阴虚血瘀的病因病机确定治则，使用针灸或穴位注射等方法治疗疾病有待于进一步研究探索。

本研究借助网络药理学分析通幽汤治疗食管癌的作用机制，结果表明通幽汤是通过多成分、多靶点、多通路的协同来发挥治疗食管癌的作用。预测的活性成分、靶点及通路与大部分文献报道相一致，说明网络药理学的研究方法具有较高可信度，能为挖掘中药潜在价值提供可靠平台。对于该研究中未提及的化合物、靶点及通路，可能原因：一、本与食管癌发生、发展、治疗机制不相关；二、相关，但尚未发现。本研究现仅借助网络药理学平台、基于生物信息学与数据库进行分析，后续将在此基础上进一步进行细胞学或动物学验证，为临床给药提供可靠依据。