福辛普利对UUO大鼠肾组织TGF-β1及Smad3的影响①

聂 晶，王 鹤，杨 松，张志光，康晓明

(1.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江 佳木斯 154003；2.佳木斯大学宏大医院，黑龙江 佳木斯 154002)

肾脏纤维化(Renal interstitial fibrosis，RIF)是各种致病因素导致的正常肾脏细胞坏死、凋亡，因肾脏再生能力较差，大量间质细胞增殖，细胞外基质堆积，引起的病理过程，是慢性肾病的最终病理类型[1，2]。炎性细胞浸润、成纤维细胞的活化增殖、细胞外基质沉积及正常肾脏组织被纤维化组织所代替是纤维化主要的病理学改变，多种细胞因子参与RIF的进展，其中TGF-β1 /Smad3为RIF的共同通路。福辛普利作为血管紧张素转换酶抑制剂，用于高血压及心衰的治疗，有研究表明，该药物可以通过升高TGF-β1 /Smad3通路上游蛋白的表达，从而发挥延缓肾脏纤维化的作用，但具体的作用机制尚不清楚。因此，通过福辛普利对UUO大鼠肾组织TGF-β1 /Smad3表达的影响，为临床延缓肾间质纤维化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

兔抗大鼠TGF-β1抗体、兔抗大鼠Smad3抗体、山羊抗兔生物素标记IgG( 购买于武汉博士德生物工程有限公司) 、DAB显色试剂盒、抗原修复液Ⅰ、SABC免疫组化试剂盒、MASSON染色试剂盒(购买于武汉博士德生物工程有限公司)。

1.2 动物分组及模型制作

将72只健康清洁的 Wistar 雄性大鼠随机均分为3组:Sham组、UUO组、福辛普利组，每组24只。其中UUO组及福辛普利组行左侧输尿管结扎。Sham组大鼠仅钝性剥离输尿管，不结扎及剪断输尿管，其余处理同前。药物治疗组(福辛普利组)每日给予福辛普利(30mg/kg·d溶于2mL生理盐水制成悬液灌胃)，Sham组及UUO模型组对应给予2mL生理盐水灌胃。

1.3 标本收集、处理及测定

各组大鼠在分别于术后第3d、7d、14d随机抽取8只大鼠处死。处死前采5mL静脉血，离心后行血尿素氮和肌酐检测。摘取左侧肾脏多聚甲醛固定，将各组肾脏组织行梯度脱水，透明处理及石蜡包埋，蜡块切片3μm，制成病理切片，行HE染色、Masson染色和免疫组化检测。

1.4 Masson染色及免疫组化结果判定

1.4.1 Masson染色

将Masson染色后的切片置于光镜下观察，400倍镜下观察Masson的结果，肾小管上皮细胞浆及细胞核呈紫红色的为阳性，选取10个不同视野，参考文献[4]方法评估肾小管间质损伤程度，用RIF指数评分表示。

1.4.2 免疫组化

将免疫组化染色的切片在在400倍光镜下观察免疫组化的结果，视野内表现为棕黄色的颗粒为染色阳性指标。随机观察10个不同视野，利用图像分析系统分析两组肾组织阳性染色( 棕黄色颗粒) 的平均光密度，用AOD表示。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 生化分析

对比Sham组3d、7d、14d大鼠血BUN、Scr未见明显异常(P>0.05)。对比UUO组及Sham组对应时间点发现，UUO组大鼠血BUN、Scr明显升高，且随着梗阻时间逐渐加重，呈现正相关，福辛普利组大鼠血 BUN、Scr较UUO组对应时间点内各指标均降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表 1。

表1 不同时间点各组生化指标

2.2 Masson染色

Masson染色显示sham组大鼠3d、7d、14d肾组织结构无明显改变，间质基本无绿染。与sham组对应时间点相比，UUO组大鼠肾组织随梗阻时间延长，间质胶原纤维逐渐绿染，肾小管上皮细胞浆及细胞核逐渐呈现紫红色，肾小管变形逐渐加重，肾小管上皮细胞逐渐萎缩、变性、坏死。见图1～4。

图1 正常肾组织(10×40)

图2 UUO组3d(10×40)

图3 UUO组7d(10×40)

图4 UUO组14d(10×40)

2.3 免疫组化

2.3.1 三组实验大鼠TGF-β1在肾组织的表达

镜下观察，Sham组各时间点TGF-β1几乎不表达，肾小管上皮细胞中无棕黄色颗粒，与Sham组相比，UUO组TGF-β1高表达，肾小管上皮细胞中可见较多棕黄色颗粒，且梗阻时间越长，棕黄色颗粒越多，差异有统计学意义(P<0．05)；与UUO组大鼠对应时间点相比，福辛普利治疗组TGF-β1表达减少，肾小管上皮细胞棕黄色颗粒减少，差异有统计学意义(P<0．05)。

2.3.2 三组实验大鼠肾组织Smad3的表达

镜下观察，Sham组大鼠肾组织内各时间点Smad3仅呈现微量表达，肾小管上皮细胞中未见明显棕色颗粒；UUO组大鼠各时间点肾组织Smad3表达较Sham组增加明显，且随着梗阻时间的增加棕色颗粒逐渐增多，差异具有统计学意义(P<0.05);与UUO组相较，福辛普利组对应时间点内Smad3表达量降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 各组大鼠肾组织TGF-β1、Smad3表达情况

3 讨论

福辛普利作为第一个含磷的血管紧张素(AngⅡ)转换酶抑制剂，临床上主要用于治疗慢性高血压及心力衰竭，有研究表明，血管紧张素转换酶参与高血压肾脏损害及肾脏纤维化的全过程,在肾脏疾病的进展中起重要作用，通过阻断血管紧张素转换酶，降低血浆和组织中AngⅡ的生成，下调TGF-β1，调节基质金属蛋白酶(MMPs)/基质金属蛋白酶特异性抑制物(TIMPs)系统，减轻肾间质纤维化程度。TGF-β是一种具有多种功能及生物学活性的细胞因子，在炎症反应调控中发挥着重要作用[5]。其中TGF-β1在肾脏中高表达，TGF-β1/Smad3信号通路是肾纤维化中最主要的激活及调控通路，TGF-β1与细胞受体结合后活化Smad3，通过核膜进入核内直接与DNA结合实现促纤维化的作用[6]。在体外培养小鼠肾细胞的试验中发现，Klotho蛋白能够减弱TGF-β1诱导的上皮-间质表型转化，抑制TGF-β1诱导的靶基因活化及Smad3磷酸化，减轻肾纤维化；本实验研究结果显示，在UUO组，TGF-β1/Smad表达上调，福辛普利组TGF-β1/Smad表达下调，考虑福辛普利可能通过抑制TGF-β1∕Smad3通路的表达，发挥抗肾间质纤维化的作用，既往有研究表明，Klotho蛋白可以抑制肾血管钙化、抗氧化应急和抑制肾脏纤维化，但是具体机制尚不详尽，国内外研究较少，结合本实验研究结果，可以再今后的实验中加入对Klotho的研究，可能为肾纤维化的临床治疗及研究提供新的作用靶点及理论依据。