无乳链球菌对星洲红鱼的致病性及药物敏感性研究

林祥日，谢丹丹，林旭吟，赵梅英

(厦门海洋职业技术学院 生物技术系，福建 厦门 361100)

上世纪80年代以来,世界范围内广泛出现鱼类链球菌感染。鱼类链球菌病已成为世界水产养殖业的主要疾病,受感染的鱼类包括多种海水、半咸水和淡水养殖鱼类[1],以罗非鱼最为易感。星洲红鱼(Red Tilapia) 隶属于鲈形目(Perciformes)、丽鱼科(Cichlidae)、罗非鱼属(Tilapia)种间杂交的一个品种,由新加坡、台湾等地的养殖专家经过二十余年的不断改良而成。其体色全红,生长速度快;耐低温能力强;肉质鲜滑爽甜,无肌间刺,与一般罗非鱼相比更受广大民众的喜爱[2]。链球菌病对罗非鱼养殖造成了严重威胁,目前有关罗非鱼链球菌病研究已有不少报道,国内、外报道主要病原有海豚链球菌(Streptococcusiniae)[3-4]和无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)[5-7]2种。有关星洲红鱼的研究主要集中在健康养殖技术[2]、形态[8-10]、染色体和细胞核 DNA含量[9]、呼吸代谢[11-12]等方面,而对星洲红鱼链球菌病研究尚少。本研究采用无乳链球菌对30～50 g大小的健康的星洲红鱼进行人工感染试验和药敏试验,旨在对无乳链球菌的致病性以及药物敏感性进行研究,以期为预防无乳链球菌引起的鱼类细菌性疾病提供一定的科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 试验用鱼 星洲红鱼来自厦门市集美灌口养殖场,体重30～50 g/尾。星洲红鱼经5 d暂养适应,稳定后供人工感染用。

1.1.2 试验材料 脑心浸液琼脂培养基(BHI)，营养琼脂培养基(NA)购自北京陆桥技术有限责任公司；药敏纸片购自杭州微生物制剂有限公司；麦氏比浊管购自广州环凯微生物有限公司。

1.1.3 菌株 感染试验用的无乳链球菌(Streptococcusagalactiae,SCTnS110902NA菌株)是由福建省淡水水产研究所提供的。

1.2 实验方法

1.2.1 人工感染试验 将无乳链球菌菌株接种于脑心浸液(BHI)琼脂培养基中,30 ℃培养48 h,用无菌生理盐水配制成2.0×109、2.0×108、2.0×107、2.0×106、2.0×105CFU/mL的细菌悬液(采用平板菌落计数法计数),每个梯度设置2组, 每组6尾,每尾肌肉注射细菌悬液0.2 mL,对照组注射相同剂量的无菌生理盐水。将试验鱼和对照鱼饲养在水温为28 ℃的不同水族箱(100 cm×50 cm×35 cm)中,连续充气,每天观察供试鱼的发病症状与死亡情况,并及时捞出死鱼,连续观察15 d。

1.2.2 人工感染后星洲红鱼体内菌落总数测定 选用2.0×108CFU/mL菌液浓度进行人工感染试验。设置试验组与对照组,其中试验组设 2组,每组20尾鱼。将无乳链球菌菌株接种于脑心浸液(BHI)琼脂培养基中,30 ℃培养48 h,用无菌生理盐水配制成2.0×108CFU/mL的细菌悬液,给2组试验鱼注射,每尾肌肉注射细菌悬液0.2 mL,对照组注射相同剂量的无菌生理盐水,将试验鱼和对照鱼饲养在水温为25 ℃的水族箱(30 cm×25 cm×50 cm)中。试验鱼一组用于统计感染无乳链球菌后星洲红鱼的症状和死亡情况,另一组用于统计体内细菌菌落数的动态变化,分别在感染后0、24、48、96、192 h随机取3尾。对照组在感染后0和192 h随机取3尾。用75%酒精擦拭鱼体表消毒,无菌解剖,检测星洲红鱼肌肉、肝脏、心脏等组织细菌动态分布。菌落总数测定方法参照GB4789.2-2016食品卫生微生物学检验菌落总数测定。

1.2.3 药物敏感试验 采用药敏纸片琼脂平板扩散法[5,13-14]。将无乳链球菌菌株接种于脑心浸液(BHI)琼脂培养基,经30 ℃培养48 h,用无菌生理盐水配制成浓度1.0×108CFU/mL细菌悬液(相当于0.5麦氏标准),用无菌微量移液枪移取100 μL细菌悬液于BHI平板上,用无菌玻璃涂棒在培养基表面上轻轻地涂布均匀,室温下静置5～10 min,适当干燥,使菌液吸附在培养基上,然后贴上药敏纸片。每皿4片,每种药物2片,倒置放入30 ℃的恒温培养箱培养48 h后,测量药敏纸片周围抑菌环直径的大小。根据杭州微生物制剂有限公司的药敏纸片法的抑菌范围解释标准判定菌株对药物的敏感度。

1.2.4 数据处理 所有的数据均用平均数±标准差(Mean±SD)形式表示。采用 SPSS软件进行方差分析和多重比较及回归分析。

2 结果与分析

2.1 人工感染试验

试验结果表明:所选用的无乳链球菌菌株对星洲红鱼具有较强的致病力。通过人工感染,注射5个不同浓度菌液的试验鱼相继出现不同程度的死亡(表1)。注射较高浓度菌液的鱼死亡数量较多,注射较低浓度菌液的鱼死亡数量较少,其中菌液浓度达2.0×109CFU/mL时,死亡率最高(91.7%)。鱼死前多数出现不安、狂游的状况。部分鱼体出现腹部出血、蛀鳍,眼球浑浊、突出等链球菌病典型症状,与自然发病鱼的症状相似。对照组在观察的时间里,表现正常,无死亡现象。

表1 人工感染试验结果

2.2 人工感染后星洲红鱼体内细菌菌落数统计

试验结果表明:对照组星洲红鱼在试验时间内(192 h)表现正常,无死亡现象。试验组星洲红鱼肌肉注射无乳链球菌悬液后,在试验时间内均未死亡,但部分鱼出现明显的发病症状,主要表现:离群独游,体表局部出血,鳍基部充血、发红,尾柄溃烂;眼球突出或浑浊发白,眼眶充血;肝脏和肾脏肿大、出血等症状。

由表2可知,星洲红鱼肌肉、肝脏的菌落数均随感染时间的延长有上升的趋势,高峰值均为感染后192 h。心脏的菌落数随感染时间变化不呈一定的规律性，但高峰值也是感染后192 h。由表3可知,对照组星洲红鱼在试验时间内(192 h)各组织的细菌菌落数少且变化不明显,t检验结果表明感染时间对对照组星洲红鱼肝脏、肌肉、心脏的菌落数无显著影响(P>0.05)。方差分析表明,不同感染时间试验组星洲红鱼肝脏、肌肉、心脏的菌落数存在极显著差异(P<0.01)(表4)。

表2 不同感染时间试验组星洲红鱼各组织的菌落数

表3 不同感染时间对照组星洲红鱼各组织的菌落数

表4 不同感染时间星洲红鱼肝脏、肌肉和心脏菌落数方差分析表

回归分析表明,星洲红鱼肌肉、肝脏的菌落数与感染时间之间均存在显著的曲线相关关系(P<0.05),可用二次曲线方程y=b0+b1x+b2x2表示,详见表5和图1～2。星洲红鱼心脏的菌落数与感染时间之间相关关系不显著(P>0.05)。

表5 星洲红鱼各组织菌落数与感染时间的回归方程的系数

图1 星洲红鱼肝脏菌落数与感染时间的关系

图2 星洲红鱼肌肉菌落数与感染时间的关系

2.3 药物敏感试验

试验结果表明,所选用的无乳链球菌菌株对青霉素G、万古霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四环素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、强力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14种药物敏感(S);该菌株对多粘菌素B、新生霉素、阿莫西林较敏感(I);该菌株对氨苄西林、头孢噻肟、丙氟哌酸、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、麦迪霉素、氟苯尼考、林可霉素、克林霉素、头孢氨苄、头孢拉定、头孢唑啉、头孢哌酮、头孢呋辛、头孢他啶、呋喃妥因、复方新诺明、磺胺甲基异恶唑等19种药物不敏感(R)(表6)。

表6 药物敏感性试验结果

3 结论与讨论

无乳链球菌病全年都可发生,水温25～37 ℃时较为流行[6,15],32 ℃以上时尤为多发[3,16],水温降至20 ℃以下时则较少。可发生于各种规格的罗非鱼,但对较大的鱼(大于100 g)更易感染[7]。发病进程和临床症状受菌液感染浓度和水温影响明显。无乳链球菌感染浓度较高时,鱼出现急性死亡,不表现明显症状;采用低浓度无乳链球菌感染时,5 d后鱼表现出眼球浑浊等亚急性感染症状[7]。尼罗罗非鱼感染无乳链球菌后,水温越高,其感染死亡率越高,高温组(33 ℃)患病罗非鱼出现打转、侧翻、离群狂游、体色发黑等临床症状。低温组(25 ℃)发病罗非鱼仅出现体色发黑、游动缓慢的症状[17]。本研究采用无乳链球菌对30～50 g健康的星洲红鱼进行人工感染试验。实验结果表明,在28 ℃水温条件下注射高浓度菌液(2.0×109CFU/mL)的星洲红鱼死亡数量较多,死前多数出现不安、狂游现象;注射较低浓度菌液的星洲红鱼则死亡数量较少,表现出亚急性感染症状。在25 ℃水温条件下注射2.0×108CFU/mL菌液的星洲红鱼在感染192 h内没有出现死亡,但出现眼球突出或浑浊发白等亚急性感染症状。这与一些学者的研究结果是相似[7,17],第二次人工感染试验星洲红鱼没有出现死亡,可能与我们当时的水温较低和试验鱼规格较小有关。

郭富强等对尼罗罗非鱼研究表明低温条件下(25 ℃)脑、肝脏、脾脏和肾脏等组织中无乳链球菌的浓度在感染后24 h或48 h即达到峰值,且组织中无乳链球菌的最大载菌量均较低[17]。朱佳杰等研究结果发现腹腔注射法可使吉富罗非鱼快速感染无乳链球菌而呈现发病症状,并在31～ 32 ℃水温感染5 h后相继出现死亡[18]。本研究采用肌肉注射无乳链球菌方式进行人工感染,仅对感染后星洲红鱼的肝脏、心脏和肌肉组织中的细菌菌落数进行统计,结果显示:25 ℃水温条件下不同感染时间试验组星洲红鱼肝脏、肌肉、心脏的菌落数存在极显著差异(P<0.01)。感染后星洲红鱼肌肉、肝脏的菌落数均随感染时间的延长有上升的趋势,心脏的菌落数随感染时间变化不呈一定的规律性,三者高峰值均为感染后192 h,以肝脏的菌落数最多。星洲红鱼肌肉、肝脏的菌落数与感染时间之间均存在显著的曲线相关关系(P<0.05),星洲红鱼心脏的菌落数与感染时间之间相关关系不显著(P>0.05)。本研究结果与一些学者报道不一致[17-18],这可能是感染试验用的菌株的毒力、试验鱼品种、机体免疫力、水温、注射部位不同所导致[19]。

无乳链球菌易产生耐药性,不同养殖环境、反复或连续用药等对无乳链球菌的耐药性有直接影响。不同无乳链球菌菌株对不同药物的敏感度有较大差异。黄艳华等研究表明无乳链球菌株对先锋霉素VI、氧氟沙星、先锋必、多西环素和盐酸沙拉沙星敏感[5]。柯剑等研究表明无乳链球菌株对环丙沙星、克拉霉素等敏感,对氨苄西林、克林霉素等耐药,且各菌株对万古霉素、庆大霉素、青霉素 G、妥布霉素、头孢唑啉、阿米卡星的敏感性有所不同[7]。本研究药敏试验结果表明:试验所用的无乳链球菌株菌株对青霉素G、万古霉素、红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、四环素、氧氟沙星、氟哌酸、左氧氟沙星、利福平、强力霉素、妥布霉素、阿米卡星、乙基西梭霉素等14种药物敏感。该菌株药敏试验结果与上述学者研究结果不尽相同,这可能是与菌株来源地间的养殖环境和用药习惯不同有关。

试验所用的无乳链球菌菌株对星洲红鱼具有较强的致病力,可选用青霉素G、阿奇霉素、克拉霉素、四环素、左氧氟沙星、利福平、强力霉素、妥布霉素、阿米卡星和乙基西梭霉素等药物防治星洲红鱼无乳链球菌病。