4种水产药物对宽体金线蛭幼苗的急性毒性研究

郭 坤，罗鸣钟，阮国良，魏 巍，李 锐

( 1.长江大学，湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北 荆州 434025； 2.浙江省农业科学院，省部共建农产品质量安全国家重点实验室(筹)，浙江 杭州 310021 )

宽体金线蛭(Whitmaniapigra)，俗称水蛭、蚂蝗、肉钻子等，《中华人民共和国药典》收录的药用水蛭的主要基原动物，属环节动物门、蛭纲、无吻蛭目、黄蛭科、金线蛭属[1]，是我国重要的水生经济动物。以宽体金线蛭为主要原料的医药制品，具有预防和治疗心脑血管疾病的特殊功效，其药用价值得到极大的提高[2-3]。医药市场对宽体金线蛭的需求主要来源于野生环境，然而由于过度捕捞和水域生态环境恶化等原因，野生宽体金线蛭资源出现匮乏，我国已有部分地区开始进行人工养殖[4]。

目前，对宽体金线蛭养殖生态学的研究主要集中在人工繁殖[5-9]、苗种培育[10-11]、养殖[12-13]等方面，已取得一系列成果，促进了宽体金线蛭规模化养殖。然而，由于高密度的养殖，养殖水体环境不良，经常暴发疾病，给养殖生产带来了较大的损失。关于安全用药方面的研究较少，水产动物对药物的敏感性差异较大，在疾病的预防和治疗中若剂量不当则可能会给养殖对象造成伤害甚至死亡。笔者通过研究硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾、辛硫磷4种常用水产药物对宽体金线蛭的急性毒性作用，旨在为宽体金线蛭合理用药和健康养殖提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

宽体金线蛭幼苗由长江大学水生经济动物研究中心提供，采回后放于实验室120 L水族箱中暂养7 d，用水为充分曝气的自来水，水温(25.0±1.5) ℃，pH 7.2～7.8，溶解氧(6.0±0.5) mg/L。供试宽体金线蛭幼苗身体健壮，活动正常，平均体质量(0.062±0.006) g。

硫酸铜(天津市北辰方正试剂厂，有效成分99%)、聚维酮碘(武汉天辰生物科技有限公司生产，有效成分10%)、高锰酸钾(郑州中天实验仪器有限公司，有效成分99%)、辛硫磷(武汉中博水产生物技术有限公司，有效成分40%)，4种水产药物按有效质量浓度配置试验液。

1.2 试验方法

宽体金线蛭具有前后两个吸盘，爬行能力较强。为防止其在毒性胁迫过程中爬离药液而造成结果的偏差，本研究中采用10 cm×10 cm×5 cm的80目封闭性网袋作为容器，网袋顶部设置一拉链结构的开口，用于放入和取出宽体金线蛭。网袋放置在40 cm×50 cm×30 cm的塑料水箱中，网袋顶部四角系一尼龙绳，尼龙绳另一端固定在水箱上，以固定网袋。水箱中液体高度为10 cm，完全淹没网袋，以保证宽体金线蛭在试验过程中一直在药液中，同一处理的3个网袋放于同一水箱中，水温为(25.0±1.5) ℃，其他水质指标与暂养期间相同。

急性毒性试验参照文献[14]的方法，选择5个间距较大的药物质量浓度进行预试验，观察宽体金线蛭在96 h内的活动情况，得出24 h全部死亡的最低质量浓度和96 h未出现死亡的最高质量浓度，根据此结果按照等对数间距设置正式试验的质量浓度。每种药物设置5个质量浓度梯度组(表1)和1个空白对照组，每个网袋放入10尾宽体金线蛭，每组设置3个平行。为保证容器中药液剂量的稳定，高锰酸钾和聚维酮碘处理组每隔12 h更换一次药液，其余组别每隔24 h更换一次。试验开始的前6 h连续观察宽体金线蛭的活动情况并记录，及时清理死亡个体，以后在24、48、72、96 h时记录成活数。死亡的判断标准为：用玻璃棒轻触静止不动的宽体金线蛭，5 min无任何反应，则判断为死亡。

表1 4种水产药物的试验质量浓度 mg/L

1.3 统计分析

采用寇式法(Karber)计算半致死质量浓度(LC50)、安全质量浓度(SC)和半致死质量浓度的95%置信区间(CI)，并做试验质量浓度对数为横坐标与死亡率为纵坐标的直线回归方程[15]，利用药物毒性蓄积程度系数(MAC)来分析宽体金线蛭体内对药物的蓄积和降减变化[16]，相关计算公式如下：

LogLC50=Xm-d(∑p-0.5)

SC=48 h LC50×0.3/(24 h LC50/48 h LC50)2

95%CI=LogLC50±1.96×d[∑(pg/n)]0.5

MAC=(t2LC50-t1LC50)/(t0LC50-tmLC50)×100%

式中，LC50为半致死质量浓度(mg/L)，SC为安全质量浓度(mg/L)，95%CI为半致死质量浓度95%置信区间(mg/L)，MAC为药物毒性蓄积程度系数(%)，Xm为最大质量浓度的对数，d为相邻质量浓度的对数差值，p为死亡率(%)，∑p为各组死亡率之和，g为存活率(%)，n为每组试验个数；t1LC50和t2LC50为观察时段t1和t2的半致死质量浓度值(mg/L)，t0LC50和tmLC50分别为试验初始、结束时半致死质量浓度(mg/L)。

2 结 果

2.1 中毒症状

各处理组，宽体金线蛭幼苗的中毒症状基本类似。试验初期，各处理组的宽体金线蛭幼苗均表现出兴奋的状态，不停游动，高质量浓度组(处理Ⅳ和Ⅴ)表现更加的兴奋，疯狂游动。3 h后，4种药液高质量浓度组的(处理Ⅳ和Ⅴ)宽体金线蛭幼苗变得安静，停留在网袋底部，宽体金线蛭身体开始卷曲并出现少量蜕皮，5 h后，低质量浓度组的宽体金线蛭也表现出类似的症状。6 h后，4种药液高质量浓度组的部分幼苗身体出现肿块和黏液分泌量增多，此外，硫酸铜和辛硫磷高质量浓度处理组的部分宽体金线蛭还出现吸盘充血和雄性生殖器外露的现象。8 h后，4种药液高质量浓度组的宽体金线蛭体色由茶褐色变为灰白色。大部分宽体金线蛭在毒性处理后临近死亡时，体表出现一层无色透明的黏液或身体末端挂着未脱离的皮。

2.2 4种常用水产药物对宽体金线蛭幼苗的急性致死效应

由表2可知，在96 h的急性毒性试验过程中，对照组的宽体金线蛭幼苗均未出现死亡情况，各质量浓度处理组宽体金线蛭的死亡率均随药物质量浓度的增加和试验时间的延长而上升。低质量浓度的高锰酸钾对宽体金线蛭幼苗的急性致死效应较小，96 h的死亡率低于30%。4种药物最高试验质量浓度对宽体金线蛭幼苗的急性致死效应均较大，96 h各组死亡率均达100%。

表2 4种水产药物对宽体金线蛭幼苗的致死率

2.3 4种水产药物对宽体金线蛭幼苗的毒性效应

根据相关计算公式[17]得出硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾及辛硫磷对宽体金线蛭幼苗的半致死质量浓度、半致死质量浓度的95%置信区间、药物毒性蓄积程度系数和安全质量浓度(表3)。半致死质量浓度均随试验时间的延长而下降，硫酸铜、聚维酮碘、高锰酸钾及辛硫磷对宽体金线蛭幼苗的24 h半致质量浓度分别为0.579、78.173、3.956、0.978 mg/L，48 h半致死质量浓度分别为0.389、67.898、3.327、0.836 mg/L，72 h半致死质量浓度分别为0.280、62.747、2.703、0.611 mg/L，96 h半致死质量浓度分别为0.241、56.058、2.313、0.493 mg/L。其安全质量浓度依次为：硫酸铜0.053 mg/L<辛硫磷0.183 mg/L<高锰酸钾0.706 mg/L<聚维酮碘15.367 mg/L。4种常用水产药物对宽体金线蛭幼苗的药物毒性蓄积程度系数随着试验时间的延长表现出不同的变化趋势。

表3 4种水产药物对宽体金线蛭幼苗的急性毒性特征分析

根据药物质量浓度对数和死亡率—概率单位的关系计算出4种药物24、48、96 h的回归方程(表4)。

表4 4种水产药物对宽体金线蛭幼苗急性毒性的回归方程分析

3 讨 论

3.1 4种药物对宽体金线蛭幼苗的急性毒性比较

半致死质量浓度是衡量药物对动物急性毒性作用强弱的关键指标，半致死质量浓度与药物毒性负相关[17]。通过试验得知4种常用水产药物对宽体金线蛭幼苗24、48、72、96 h的半致死质量浓度值，但实际生产中多采用96 h半致死质量浓度来确定药物对水生动物的急性毒性大小。根据国家环保总局发布的毒性分类标准[18]，急性毒性96 h半致死质量浓度<0.1 mg/L为剧毒，0.1～1.0 mg/L为高毒，1.0～10.0 mg/L为中毒，>10.0 mg/L为低毒。

本研究结果显示，硫酸铜和辛硫磷对宽体金线蛭幼苗的96 h半致死质量浓度分别为0.241、0.493 mg/L，均属高毒。高锰酸钾的96 h半致死质量浓度为2.313 mg/L，属中毒。聚维酮碘的96 h半致死质量浓度为56.058 mg/L，属低毒。这4种药物对宽体金线蛭幼苗的毒性依次为硫酸铜>辛硫磷>高锰酸钾>聚维酮碘。

3.2 4种药物在宽体金线蛭幼苗体内的蓄积与降减的特征分析

药物毒性蓄积程度系数常作为生物对毒物敏感程度差异的指示参数，来分析生物体对药物的蓄积与降减动态[19]。其值越大，即毒效蓄积幅度越大，生物抗毒能力下降，致死率就越大；其值大于0时，蓄积作用强度大于降减作用，反之亦然。

由表3可知，硫酸铜和聚维酮碘的药物毒性蓄积程度系数在24～48 h出现最大值，而高锰酸钾和辛硫磷的药物毒性蓄积程度系数值在48～72 h出现最大值，表明4种药物的毒性分别在这两个时间段在宽体金线蛭体内蓄积作用较强，即为死亡高峰阶段；过此阶段后，药物毒性蓄积程度系数出现下降，表明宽体金线蛭对药物的抵抗能力上升，毒性减弱。通过比较4种药物的药物毒性蓄积程度系数，发现宽体金线蛭对高锰酸钾在各试验阶段的蓄积幅度变化不大，表明其毒性蓄积较强，降解毒性能力较差；在试验48～96 h宽体金线蛭对硫酸铜和辛硫磷的药物毒性蓄积程度系数下降明显，硫酸铜试验72～96 h的药物毒性蓄积程度系数是24～48 h的45.57%，辛硫磷试验72～96 h的药物毒性蓄积程度系数是24～48 h的20.36%，说明其降解毒效能力较强，毒效蓄积速度下降。因此，在研究药物对动物的毒性效应时，应当分析药物毒性蓄积变化，充分考虑时效对其影响。

3.3 生产过程中几种水产药物的使用注意事项

硫酸铜是水产病害防治中的常用药物，游离的铜离子能够破坏氧化还原酶系统的活性，使酶失去活性而具有抗病原体的作用[20]。本试验中硫酸铜对宽体金线蛭幼苗的安全质量浓度为0.053 mg/L，远低于常用剂量0.5 mg/L，重金属铜离子易在体内积累且温度较高时毒性会加大，从而引起机体血液、生理生化及组织病理等变化[21]，因此建议禁止硫酸铜作为宽体金线蛭病害防治的药物。

聚维酮碘为常用的消毒剂，是通过氧化病原体原浆蛋白的活性基因，并与蛋白的氨基结合而使其变性，从而有效杀死细菌、真菌、病毒及原虫等病原体[22-23]。在水产苗种繁育过程中聚维酮碘的常用量为2～5 mg/L，本试验中聚维酮碘对宽体金线蛭幼苗的安全质量浓度为15.367 mg/L，大于常规剂量。因此聚维酮碘作为宽体金线蛭幼苗养殖过程中消毒剂可以安全使用。

高锰酸钾是一种强氧化剂，通过释放新生态氧，迅速氧化有机物，而起到杀菌、杀虫的作用，常用于防治鱼虾等细菌、真菌和寄生虫类疾病及设施、工具的消毒[24]。本试验中高锰酸钾对宽体金线蛭幼苗的安全质量浓度为0.706 mg/L，小于生产上高锰酸钾全池泼洒的剂量(1～2 mg/L)。因此，建议除对养殖设施和工具的消毒外，在宽体金线蛭培育过程中应谨慎使用高锰酸钾，如使用建议采用短时间浸泡方法，并注意用药时间和观察宽体金线蛭的行为。

辛硫磷是一种高效低毒的有机磷杀虫剂，在防治寄生虫性疾病中发挥重要作用，通过抑制胆碱脂酶活性，引起乙酰胆碱代谢紊乱，引起神经中毒，常用剂量为10 μg/L[25]。然而，当其剂量超过水产动物的安全用量时，会通过影响机体抗氧化系统干扰生物体的功能[26]。本研究结果显示，辛硫磷对宽体金线蛭幼苗的安全质量浓度为0.183 mg/L，高于常用剂量。因此，在常用剂量范围内，可以作为宽体金线蛭疾病防治的药物。