仿刺参体腔液中皮质醇检测方法研究

2020-07-28刘桂英吴金浩王志松

水产科学 2020年4期

刘桂英，田金，肖瑶，吴金浩，宋伦，高颖，王志松

( 辽宁省海洋水产科学研究院，辽宁大连 116023 )

皮质醇含量是反映肾上腺皮质功能的重要指标之一，海洋动物血清中的皮质醇激素含量随应激强度呈现规律性变化，是可以用来衡量应激水平的重要生理指标[1]。皮质醇分泌过多或者不足，均会导致机体免疫功能下降，增加动物发生病害的几率[2]。机体分泌皮质醇受外部环境影响，如拥挤和剧烈振荡胁迫造成草鱼(Ctenopharyngodonidellus)血液内皮质醇含量大幅度升高[3-4]；船舶噪声影响有机体中的皮质醇水平，破坏有机体的繁殖发育和生长[5]；环境压力促使鱼类生成皮质醇激素，影响机体的新陈代谢等功能[6]。关于皮质醇的研究主要集中在海洋脊椎动物[7-13]，而海洋棘皮动物皮质醇的相关研究报道较少。仿刺参的体腔液类似于血液，研究仿刺参体腔液中皮质醇的含量来评价仿刺参(Apostichopusjaponicus)的应激水平，对于了解仿刺参的应激能力和免疫水平等生理功能具有重要意义。

目前测定血清皮质醇有化学发光法、放射免疫法、蛋白竞争法和高分辨质谱法等[14-18]，常用的是化学发光法，它具有检测迅速、操作简单等优点，但受血清蛋白结合的影响，不能反映实际发挥功能的皮质醇的情况；若基质不同，结合蛋白不同，会导致皮质醇的测定结果不准确[19-20]。因此，研究仿刺参体腔液中皮质醇的测定方法，对进一步探索皮质醇对仿刺参生理行为的影响，具有科学指导意义。

笔者基于超高效液质联用的检测方法，结合固相萃取的前处理技术，建立仿刺参体腔液中皮质醇的检测方法。通过优化前处理技术，采用梯度洗脱的分离方式，以建立快速、灵敏、稳定的仿刺参体腔液皮质醇检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验仿刺参

仿刺参取自辽宁省海洋水产科学研究院实验基地，分别为3龄仿刺参和幼参若干，自基地运回后，于循环水养殖系统中暂养10 d，暂养期间水温保持在(25.0±0.5) ℃，盐度约30，光照周期为14L∶10D。每日16:00过量投喂幼参1次，3龄参此温度下进入夏眠不摄食。饲料为辽宁省海洋水产科学研究院自研饲料，主要由鱼粉、鼠尾藻(Sargassumthunbergii)粉、马尾藻(Sargassumsp.)粉、海带(Saccharinajaponica)粉和酒糟等组成。每日清污换水1次，24 h连续充气。

1.2 仪器与试剂

Xevo TQD型超高效液相色谱质谱仪(美国 Waters公司)、氮吹浓缩仪(天津市恒奥科技发展有限公司)、Milli-Q超纯水仪(美国 Milliopore公司)、离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司)、超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)、固相萃取柱(美国安捷伦公司，300 mg，3 mL)。

1.3 标准溶液配制

准确称取适量(精确至1.0 mg)皮质醇标准品，用乙腈溶解，配制质量浓度为1 mg/L的标准储备液，4 ℃保存，临用时稀释成所需用量。

1.4 样品前处理

取样时，将仿刺参置于冰盘中，自腹面剖开约1 cm，用1 mL无菌注射器吸取体腔液, 3龄参每头吸取5 mL体腔液组成一个样品; 因幼参体腔液含量少，为保证样品充足，每头吸取1 mL， 5头幼参的体腔液共5 mL合为一个样品。将抽取的体腔液置于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL甲酸乙腈混合溶液(在10 mL乙腈中加入20 μL的甲酸)，充分摇匀，涡旋，加入1 g的氯化钠和4 g无水硫酸钠，充分涡旋混匀1 min，超声10 min，静置，以5000 r/min，4 ℃离心15 min，取乙腈相上清液4 mL，放入空的聚丙烯塑料离心管中，加入1 mL水，混匀，将待测溶液全部转入，过固相萃取柱，重力自流，抽干小柱，收集全部流出液，45 ℃水浴浓缩，氮吹仪氮吹至液面高度恒定，用去离子水定容至1 mL，上清液经水相滤膜0.22 μm过滤至进样瓶中，供超高效液相色谱—串联质谱分析。

1.5 色谱条件

色谱柱：BEH C-18色谱柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)；柱温：30 ℃；流动相：A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.2 mL/min。梯度洗脱程序见表1，进样体积10 μL。

表1 二元梯度洗脱顺序

1.6 质谱条件

电喷雾电离(ESI+)源，正离子扫描；多反应监测(MRM)模式；离子源温度：650 ℃；毛细管电压：3.20 kV；锥孔电压：45 V；脱溶剂气温度：400 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h，锥孔气流量：50 L/h。

2 结果与分析

2.1 线性关系、检出限和定量限

采用样品基质提取液配制质量浓度为0、5、10、20、50、100 μg/L的系列标准溶液，以质量浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线，得到目标化合物的线性回归方程y=197.8x-1192和相关系数r=0.9920，结果表明，皮质醇在质量浓度0～100 μg/L内呈良好的线性关系，以3倍和10倍信噪比确定该化合物的仪器检出限和定量限，分别为0.11 μg/L和0.35 μg/L。

2.2 回收率和精密度

取空白样品，分别添加20、40、100 μg/L质量浓度水平的皮质醇，每个质量浓度水平测定5份平行样品，考察方法的回收率和精密度，平均回收率分别为77%、96%和105%，精密度分别达到5.6%、3.2%和2.8%，试验结果表明，本方法有较高的准确度和精密度，适合实际样品的测定。

2.3 实际样品测定

用本试验所建立的方法，对幼参和3龄参体腔液进行检测，幼参体腔液中未检出皮质醇，3龄参混合体腔液中皮质醇的含量为6.91 μg/L，雌3龄参体腔液中皮质醇含量为6.28 μg/L，雄3龄参体腔液中皮质醇含量为6.21 μg/L，实际样品与标准品溶液多重反应监测色谱图见图1。本试验的样品检测结果与周晓梦等[21]结果不同，周晓梦等[21]是用平均体质量(31.68±3.29) g的仿刺参，而本试验用的是平均体质量(15±2.59) g的仿刺参，分析可能是由于个体差异所致。

图1 实际样品与标准品溶液多重反应监测色谱

3 讨论

3.1 色谱条件的优化

因皮质醇为极性化合物，常用的色谱柱为C-18柱，本试验采用BEH C-18柱和BEH HILIC柱在同一条件下进行分离，通过比较发现，BEH C-18柱的分离效果好于BEH HILIC柱，目标化合物的峰型尖锐，且相同质量浓度信号响应值高。乙腈和水、甲醇和水是液质分析常用的流动相，用这两种流动相组成进行分析可知，乙腈和水的效果优于甲醇和水，在水中加入了0.1%的甲酸后，增强了目标物的离子化效率，减小了基质效应，在相同浓度峰响应值增高(图1)。

流速和柱温对保留时间和峰型均有影响。流速增加、柱温升高均会使皮质醇的保留时间减小，峰宽变窄，峰型对称尖锐，但若流速太大，柱温太高，对色谱柱有损伤，减少色谱柱的寿命。选取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL/min的流速进行试验，结果表明，在流速0.2 mL/min和柱温30 ℃时效果最佳。

3.2 质谱条件的优化

在ESI+模式下对0.5 mg/L的皮质醇标准溶液进行质谱扫描分析，得到该化合物的分子离子峰[M+H]+，以分子离子为母离子，对其进行二级质谱扫描，质谱参数见表2。

表2 皮质醇的质谱参数

3.3 提取试剂的优化

有机提取常用试剂有乙腈、甲醇、氯仿等，根据文献[18]，先用氯仿提取皮质醇，结果发现，氯仿的提取率较低，改用100%甲醇、80%甲醇、100%乙腈及80%乙腈对加标样品进行提取，通过回收率比较提取效率，结果见图2。由图2可知，80%乙腈的提取效率高，为90%，由于添加甲酸能促进皮质醇提取，故在80%乙腈中，加入不同含量的甲酸进行提取，结果发现，80%乙腈中加入0.2%甲酸提取效率高，达到95%。为除去仿刺参体腔液的水分，加入无水硫酸钠和氯化钠，促使待测物由水相转移到有机相。经过多次优化试验，得到最佳的提取条件为10 mL 80%乙腈+0.2%甲酸、4 g无水硫酸钠、1 g氯化钠。

图2 不同提取溶剂对皮质醇提取效率

3.4 净化条件的优化

由于样品基质中蛋白质和脂类含量较为丰富，干扰组分多，对净化方法要求较高，液—液净化法及基质固相分散法难以达到净化要求，其提取液仍需进一步净化方可用于仪器检测。因此本研究通过试验考察对比了Oasis HLB固相萃取柱、OasisPrime固相萃取柱、Captiva EMR-Lipid固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱的纯化效果(图3)，结果发现，Oasis HLB固相萃取柱虽有一定的净化效率，但比较费时，需要经过活化、平衡和淋洗3个步骤。OasisPrime固相萃取柱和Bond Elut Plexa固相萃取柱提取效率较低。只有Captiva EMR-Lipid固相萃取柱提取效率高，操作时间短，只需将提取溶液直接过柱，保持一定的速度，就能快速去除脂肪、磷脂等杂质，减小基质效应，节省时间和溶剂。因此，选择使用Captiva EMR-Lipid 固相萃取柱作为净化小柱。

图3 不同类型固相萃取柱提取皮质醇的回收率

3.5 基质效应的评价

基质效应主要是由于样品在离子化时基质成分与目标化合物相互竞争电离所致，包括基质增强效应和基质抑制效应。在液相色谱—串联质谱定性定量分析中，基质效应会对仪器的灵敏度和重复性产生影响，进而影响检测结果的准确性。体腔液的组织成分复杂，含有蛋白质、磷脂、氨基酸等大分子化合物，可能会抑制或增强基质效应。本试验采用(基质匹配标准曲线的斜率/溶剂标准曲线的斜率-1)的计算方法对皮质醇的基质效应进行评价[22]。当结果为正值时表示基质增强效应，结果为负值时表示基质抑制效应，绝对值越大则基质效应越强。通常认为，基质效应在±20%内为不显著[23]。根据计算得知，仿刺参体腔液中皮质醇的基质效应为-15.3%，说明皮质醇存在基质效应，但影响不显著，因此，为保证检测结果的准确性，选择相应空白基质溶液配制标准溶液绘制校正曲线来进行定量分析。