病毒性脑炎患儿外周血miR-146a、miR-146b表达检测及临床意义

魏从真 赵小洁 李彦明 柴越 边策 赵帅

[摘要] 目的 檢测病毒性脑炎患儿外周血miR-146a、miR-146b的表达，并探讨其临床意义。 方法 回顾性分析2016年6月～2019年6月河北医科大学第一医院（以下简称“我院）收治的62例病毒性脑炎患儿的临床资料和同期在我院体检的43名健康儿童的资料，分别记为研究组和对照组。根据感染病毒类型将研究组进一步分为研究A组（单纯疱疹病毒7例）、研究B组（带状疱疹病毒9例）、研究C组（肠道病毒28例）、研究D组（腮腺病毒6例）、研究E组（流行性乙型病毒12例）5个亚组。比较研究组、对照组及研究组各亚组中轻型和重型的miR-146a、miR-146b水平;比较研究组和对照组T淋巴细胞亚群水平，分析研究组外周血miR-146a、miR-146b与T淋巴细胞亚群的相关性，比较不同预后患儿外周血miR-146a、miR-146b水平。 结果 不同研究组亚组和研究组miR-146a、miR-146b均高于对照组（P < 0.05），且重型患儿均高于轻型患儿（P < 0.05）;不同研究组和研究组亚组CD+3、CD+4及CD+4/CD+8均低于对照组（P < 0.05），而CD+8均高于对照组（P < 0.05）;不同研究组和研究组亚组miR-146a、miR-146b与CD+3、CD+4、及CD+4/CD+8均呈负相关（P < 0.05），与CD+8均呈正相关（P < 0.05）;研究组预后不良率为17.74%，预后不良患儿miR-146a、miR-146b均高于预后良好者（P < 0.05）。结论 病毒性脑炎患儿外周血miR-146a、miR-146b的表达水平均升高，能够反映病情并与T淋巴细胞亚群具有相关性，且可以预测预后情况。

[关键词] 病毒性脑炎;miR-146a;miR-146b;T淋巴细胞亚群

[中图分类号] R512.3          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）06（b）-0096-05

Detection of peripheral blood miR-146a and miR-146b levels in children with viral encephalitis and their clinical significance

WEI Congzhen   ZHAO Xiaojie   LI Yanming   CHAI Yue   BIAN Ce   ZHAO Shuai▲

The First Clinical Laboratory， the First Hospital of Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang   050000， China

[Abstract] Objective To detect the peripheral blood miR-146a and miR-146b levels in children with viral encephalitis， and to explore their clinical significance. Methods Clinical data of 62 children with viral encephalitis admitted to the First Hospital of Hebei Medical University （“our hospital” for short） from June 2016 to June 2019 and the physical examination data of 43 healthy subjects during the same period in our hospital were retrospectively analyzed， and they were recored as study group and control group respectively. The study group was further divided into 5 subgroups according to the virus type： study group A （7 cases of herpes simplex virus）， study group B （9 cases of herpes zoster virus）， study group C （28 cases of enterovirus）， study group D （6 cases of parotid virus）， and study group E （12 cases of epidemic virus B）. The levels of miR-146a and miR-146b between the study group， the control group and mild and severe cases of subgroups of study group were compared. The levels of T lymphocyte sub-population were compared between the study group and the control group. The correlations between the levels of miR-146a and miR-146b in peripheral blood and T lymphocyte sub-population levels in study group were analyzed. The levels of miR-146a and miR-146b in peripheral blood of different prognosis were compared. Results The levels of miR-146a and miR-146b in the study group and different sub-groups of the study group were higher than those in the control group （P < 0.05）， of which the severe cases were higher than the mild cases （P < 0.05）. The CD+3， CD+4 and CD+4/CD+8 in the study group and different sub-groups of the study group were lower than the control group （P < 0.05）， while the CD+8 levels were higher than the control group （P < 0.05）. The levels of miR-146a and miR-146b of the study group and different sub-groups of the study group were negatively correlated with CD+3， CD+4， and CD+4/CD+8 （P < 0.05）， which were positively correlated with CD+8 （P < 0.05）. The levels of miR-146a and miR-146b in children with good prognosis were significantly lower than those with poor prognosis （P < 0.05）. Conclusion The levels of miR-146a and miR-146b in children with viral encephalitis increase， which can reflect the severity of the conditions and have correlations with the T lymphocyte sub-population， which can predict the prognosis.

[Key words] Viral encephalitis; miR-146a; miR-146b; T-lymphocyte sub-population

病毒性脑炎是指脑实质有病毒直接入侵而引起的原发性脑炎[1]。据统计，病毒性脑炎的死亡率为60%～80%[2]。病毒性脑炎早期症状呈现多样性，导致临床误诊或者漏诊的概率较大。miR-146a、miR-146b与人类多种疾病密切相关，可反映机体的炎性反应情况和免疫功能[3]。研究证实，miR-146a、miR-146b可参与炎性反应和免疫反应等，可能与病毒性脑炎的发生和发展有关[4]。鉴于此，本研究特设计回顾性分析，探讨病毒性脑炎患儿中miR-146a、miR-146b表达水平的临床价值和意义，现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016年6月～2019年6月河北医科大学第一医院（以下简称“我院”）收治的62例病毒性脑炎患儿的临床资料和同期在我院体检的43名健康儿童的资料，分别作为研究组和对照组。其中研究组男41例，女21例;年龄6个月～11岁，平均（6.41±1.23）岁;感染病毒类型：单纯疱疹病毒7例，带状疱疹病毒9例，肠道病毒28例，腮腺病毒6例，流行性乙型病毒12例，分别记为研究A组（轻型4例、重型3例），研究B组（轻型5例、重型4例），研究C组（轻型18例、重型10例），研究D组（轻型4例、重型2例），研究E组（轻型8例、重型4例）。轻型患儿39例，其中男26例，女13例;年龄6个月～10岁，平均（6.42±1.22）岁。重型患儿23例，男15例，女8例;年龄8个月～11岁，平均（6.38±1.24）岁。对照组男28名，女15名;年龄8个月～12岁，平均（6.61±1.36）岁。研究组和对照组性别、年龄比较，差异均无统计学意义（χ2=0.475，P = 0.526;t = 0.698，P = 0.302），重型组和轻型组性别、年龄比较，差异无统计学意义（χ2=0.396，P = 0.621;t = 0.742，P = 0.228）。本研究已经我院医学伦理委员会批准。

研究组纳入标准，①符合病毒性脑炎诊断标准[5]：急性或亚急性发病，多伴有发热，有明确脑实质损害表现，脑脊液检查可呈非化脓性改变，提倡与中心实验室协作进行病毒病因学检查明确感染的病毒类型，多数患儿脑电图主要表现为背景节律显著慢化，呈弥漫性，且头颅CT或MRI检查可见脑水肿，大多无其他异常，部分病情严重的患兒可显示炎性病灶形成界限不清、大小不等、不规则的低密度或高密度影，若为单纯疱疹病毒感染易侵犯颞叶等且可出现局灶性病变及相应表现，若大脑皮层广泛重度损害，脑电图可出现？簟波，脑脊液检查可见异常但也有少数患儿脑脊液完全正常;②初诊患儿;③予以对症治疗，且有完整的资料信息。排除标准：①细菌性脑膜炎者;②结核性脑膜炎者;③伴其他免疫或者感染性疾病者;④恶性肿瘤者;④既往神经功能缺损史者。

1.2方法

1.2.1 外周血miR-146a、miR-146b检测  两组均采取外周静脉血6 mL，研究组于入院当天采血，对照组于体检当天采血，3500 r/min离心10 min，离心半径：12.5 cm，提取血清，置于-70℃冰箱保存备测。采用实时荧光定量聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术检测两组研究对象外周血miR-146a、miR-146b表达水平。用移液枪取血清加入细胞裂解液，用总RNA提取试剂盒（Invitrogen，美国，生产批号：151211 001A）提取RNA，利用紫外分光光度计检测总RNA纯度，采用逆转录试剂盒（Fermentas，美国，生产批号：151215BRNA）将总RNA进行逆转录，以U6为内参，具体操作按照试剂盒说明书进行。miR-146a上游引物：5′-AGAGCGGAGTGTTTATGTCAACT-3′，下游引物：5′-ACCCTGTAGATCCGAATTTGTGTAA-3′;miR-146b上游引物：5′-GAGCGGAGTTTACGTGATCGTAGCT-3′，下游引物：5′-GTAGCTGATGCTAGCTAGATAGCTA-3′。反应体系：2×miR Premix（含SYBR和ROX）10 μL+上下游引物各0.4 μL+miR cDNA 5 μL+50×ROX reference dye 1.6 μL，最后向其中加入ddH2O，整个反应体系共20 μL。PCR反应条件：95℃ 10 min，95℃变性10 s，60℃退火30 s，74℃延伸30 s，连续进行40次循环，每个样品均设3个平行反应孔。采用2-ΔΔCt法进行miR-146a、miR-146b的相对定量分析。

1.2.2 研究组病情判断  按有无意识改变或癫痫发作或出现神经系统定位体征，分为轻型和重型[6]。轻型：仅有一般脑病特征;重型：出现昏迷或癫痫发作或神经定位系统体征。

1.2.3 T淋巴细胞亚群检测  两组均采取外周静脉血5 mL，研究组于入院当天采血，对照组于体检当天采血，3000 r/min离心10 min，离心半径8.0 cm，加入CD3、CD4和CD8单抗（购自美国贝克曼库尔特公司，生产批号：160412001A、160409003A、160420008C），并加入T4-FITC单抗（购自美国贝克曼库尔特公司，生产批号：160407002B），采用流式细胞仪（Epics XL型，美国贝克曼库尔特公司）检测，并利用仪器自带软件分析血清T淋巴细胞亚群CD+3、CD+4、CD+8占比，计算CD+4/CD+8。

1.2.4 研究组预后判断方法  统计研究组预后不良情况发生率，参考文献[7]将癫痫、精神异常、持续性头痛、瘫痪或死亡记为预后不良。

1.3 统计学方法

采用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，若不符合正态分布需首先进行正态性转化，多组比较采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验;计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，相关性分析采用Pearson相关性分析法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各組外周血miR-146a、miR-146b水平比较

研究组及其各亚组外周血miR-146a、miR-146b水平均高于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.2不同病情患儿miR-146a、miR-146b水平比较

研究组及其各亚组中，重型患儿外周血miR-146a、miR-146b水平均高于轻型，差异均有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

2.3 两组T淋巴细胞水平比较

研究组及其各亚组CD+3、CD+4、以及CD+4/CD+8值均低于对照组，差异均有统计学意义（P < 0.05），且CD+8比例高于对照组（P < 0.05），且研究组各亚组中T淋巴细胞亚群水平比较，差异均无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

2.4 研究组miR-146a和miR-146b水平与T淋巴细胞亚群的相关性分析

研究组及其各亚组患儿miR-146a、miR-146b水平与CD+3、CD+4水平及CD+4/CD+8呈负相关（P < 0.05），与CD+8呈正相关（P < 0.05）。见表4。

2.5 不同预后患儿miR-146a、miR-146b水平比较

治疗2周后，5例患儿精神智力障碍，3例患儿癫痫，2例患儿瘫痪，1例患儿死亡，共有11例患儿预后不良，其中研究A、B、C、D、E组分别有1、1、6、1、2例预后不良，预后不良率为17.74%。研究组及其各亚组中，预后不良患儿miR-146a、miR-146b水平均高于预后良好患儿，差异均无统计学意义（P < 0.05）。见表5。

3 讨论

病毒性脑炎致死率极高，可损伤机体免疫功能[8]。病毒冲破血脑屏障入侵脑实质可引发脑部广泛性的中枢神经系统病变[9]。有研究报道，细胞及细胞因子在发病过程中起重要作用，miR-146家族（miR-146a、miR-146b）与细胞生长、增殖、分化、凋亡以及机体免疫活动密切相关[10]。因此探讨外周血miR-146a、miR-146b在病毒性脑炎患儿中的表达及意义有重要作用。

本研究结果中，研究组和不同类型病毒感染患儿外周血miR-146a、miR-146b水平均高于对照组，提示病毒性脑炎患儿外周血miR-146a、miR-146b表达水平升高，且不同类型病毒感染患儿外周血miR-146a、miR-146b水平均高于健康儿童。miR-146a、miR-146b均可迅速诱导和促进炎性反应，还可抑制核因子（NF）-κB活化，影响机体免疫[11]。当机体受到炎症刺激时，宿主细胞中的miR-146a、miR-146b被激活，其水平升高，并诱发炎性反应和免疫应激[12]。本研究结果显示，重型组miR-146a、miR-146b表达水平均高于轻型组，提示病毒性脑炎外周血miR-146a、miR-146b与病情相关，且在不同类型病毒感染患儿中均表现出该趋势。有研究报道，病毒性脑炎机体中的单核细胞、中性粒细胞以及多种免疫细胞可由于受到感染刺激产生大量炎症介质，加重病情[13]，而miR-146a、miR-146b可引起机体代偿性炎性反应[14]，因此其水平与病情相关。

本研究结果还显示，研究组和不同类型病毒感染患儿CD+3、CD+4、CD+4/CD+8均低于对照组，且CD+8均高于对照组，提示病毒性脑炎患儿的T淋巴细胞亚群发生紊乱，免疫功能减低，且不同类型病毒感染患儿T淋巴细胞亚群指标均有异常。机体内CD+3细胞反映细胞免疫功能状态，CD+4是辅助性T淋巴细胞，CD+4/CD+8反映机体炎性反应和免疫平衡的状态，CD+8主要是抑制机体免疫反应，患儿发生病毒性脑炎时，前三者水平降低，后者水平升高，说明机体的免疫功能失调[15-16]。一旦病毒性脑炎发病，miR-146a、miR-146b升高，致使黏附到脑血管外皮细胞中的T细胞和初级T细胞减少，进而影响T淋巴细胞和血-脑脊液屏障的功能，导致免疫调节失衡[17]。本研究结果还发现，研究组及不同类型病毒感染患儿外周血miR-146a和miR-146b表达水平与CD+3、CD+4水平及CD+4/CD+8均呈负相关，与CD+8均呈正相关，提示miR-146a和miR-146b表达水平可以反映免疫功能指标。有研究显示[18]，miR-146a和miR-146b表达水平与机体的免疫功能呈现负相关，可用于反映机体的免疫功能。

此外本研究发现，预后不良患儿miR-146a、miR-146b水平均高于预后良好者，提示二者可能与病毒性脑炎患儿的预后有关。病毒感染后，机体内miR-146a、miR-146b水平过高可引发代偿性炎性反应[19]，导致病情加重，并且二者还可促进淋巴细胞增殖和生长，影响免疫应答反应，进而加重病情[20]，因此可影响预后。

综上，外周血miR-146a、miR-146b参与病毒性脑炎的发病及发展过程，可以作为反映病毒性脑炎患儿病情和机体免疫功能的重要指标，且二者水平越高患儿预后不良的风险很可能也越高。本研究的不足在于受病毒类型检验难度大、病例少等限制所选样本量稍少，可能造成结果偏倚，后期应扩大样本量进一步探讨。

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（收稿日期：2020-01-08  本文编辑：任   念）