细胞学诊断在浆膜腔积液中的应用现状

摘要：细胞学检查是诊断浆膜腔积液的重要手段，不仅可以评估疾病的良恶性，还可以用于判断肿瘤的类型、来源、预后等方面的信息。本文主要从制片技术、肿瘤标志物检测、DNA倍体分析、免疫组化和分子病理在浆膜腔积液中的应用进行综述，旨在为浆膜腔积液的临床诊治提供参考。

关键词：浆膜腔积液;肿瘤标志物;免疫细胞化学;DNA倍体

中图分类号：R446.8                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.13.009

文章编号：1006-1959（2020）13-0030-05

Application Status of Cytological Diagnosis in Serous Cavity Effusion

LIANG Hai-hong

（Department of Pathology，Tianjin Port Hospital，Tianjin 300456）

Abstract：Cytological examination is an important method for diagnosing serous cavity effusion. It can not only evaluate the benign and malignant diseases， but also be used to judge the type， source， and prognosis of tumors. This article mainly reviews the application of preparation technology， tumor marker detection， DNA ploidy analysis， immunohistochemistry and molecular pathology in serous cavity effusion， aiming to provide reference for clinical diagnosis and treatment of serous cavity effusion.

Key words：Serous cavity effusion;Tumor markers;Immunocytochemistry;DNA ploidy

浆膜腔积液（serous effusion）是指胸腔、腹腔和心包腔内过多液体积聚形成，是临床上常见的良性或恶性疾病的并发症。浆膜腔积液良、恶性的诊断及鉴别诊断是临床的一个难题，细胞病理学检查是其诊断的重要方法。细胞病理学检测方法在不断改进，每种方法各有其优缺点，近几年DNA倍体分析方法的应用可以发现早期病变的肿瘤细胞，免疫细胞化学可以帮助判断肿瘤的类型及来源，分子病理可以帮助基因诊断及治疗，多种方法联合应用可提高诊断的准确率。本文对近年来浆膜腔积液诊断方法作一综述，旨在为该病的诊断与鉴别诊断提供参考。

1传统涂片和液基薄层制片

合格的细胞涂片是细胞病理学診断的基础，细胞涂片的主要制备方法包括两种：传统涂片法和液基薄层制片法。将送检积液标本离心后手工制成传统细胞涂片HE染色;也可以上机进行液基薄层制片，巴氏染色;两种方法均可通过显微镜观察初步做出有无恶性细胞或非典型细胞存在的诊断。传统涂片法是简单易行的一种方法，省时，成本低，基层医院即可实行;缺点：由于是人工涂片，会出现厚薄不均、大量红细胞及黏液混杂，造成背景不清晰，阳性检出率低。在整个制作涂片过程中，取样最为重要，根据标本性质的不同采用不同的处理方式是制作优质涂片的关键[1]。有研究认为固定是制备合格细胞涂片的前提条件，涂片后即使在空气中暴露短短30s，足以使部分细胞发生变性、肿胀，染色质不清，若干燥后再固定则所有细胞会出现退变。因此需要及时湿固定，即涂片后立即置入95%乙醇中，且涂片过程要迅速，不宜在空气中暴露[2]。液基薄层细胞涂片是对传统涂片的一种改进，成本相对较高，但是制片过程采取了湿固定，具有细胞核、浆结构清晰，均匀分布于玻片，薄层，巴氏染色鲜艳，血液和粘液成分少，背景清晰等优点，利于显微镜观察诊断。禹乐等[3]研究显示，液基薄层细胞涂片法恶性肿瘤确诊率为30.8%，高于传统细胞涂片法的11.2%，其在胸腹水诊断中可以提高恶性肿瘤的确诊率，且涂片质量、染色效果均优于常规涂片法。

2肿瘤标志物检测

肿瘤标志物是肿瘤细胞产生的一些物质，可以在恶性肿瘤患者的血液、尿液、粪便或其他体液中检出。肿瘤标志物在肿瘤中的检测和治疗中发挥着越来越重要的作用[4]。血清肿瘤标志物检测是最常用的方法，近年来浆膜腔积液肿瘤标志物的检测也越来越受重视。有研究比较患者血清及浆膜腔积液中肿瘤标志物的的含量，发现浆膜腔积液中肿瘤标志物明显高于血清中含量[5]。

癌胚抗原（CEA）是一种临床上常用的肿瘤标志物，常见于胃肠道恶性肿瘤，也见于乳腺癌、肺癌、宫颈癌、卵巢癌及其他一些非恶性病变，属于广谱肿瘤标志物。有研究显示恶性组胸腔积液及血清肿瘤标志物均高于良性组和对照组，CEA是敏感性最高（41.6%），特异性最高（100%），准确率最高（74.1%）[6];胸腔积液CEA诊断非小细胞肺癌的敏感性为100%，胸腔积液和阴性胸腔细胞学患者胸腔积液CEA水平升高提示需要更具侵袭性的手术（如VATS引导的活检），而低胸腔积液CEA可能支持随访[7]。有研究指出CEA是区分良恶性胸腔积液的最佳单一指标，CEA和CA15-3比CA125和CA19-9更可靠地鉴别良恶性胸腔积液[8]。CYFRA21-1是细胞角蛋白19的片段，临床上主要用于非小细胞肺癌（NSCLC）的诊断[9]，研究显示胸腔积液CYFRA 21-1加CEA、胸腔积液CYFRA21-1加血清CYFRA21-1的并行诊断大大提高了恶性胸腔积液诊断的敏感性和准确性[10]。胸腔积液肿瘤标志物CEA、CYFRA21-1和CA19-9联合应用可将诊断肺腺癌敏感性提高到95.06%[11]。CYFRA21-1与CA125联合应用诊断恶性腹水的敏感性为65.5%，特异性为96.5%，提高了恶性腹腔积液的诊断准确性[12]。sB7-H4即可溶性B7-H4（Soluble B7-H4）属于B7家族成员，主要通过负向调控相关T细胞免疫过程而诱发癌变[13]。有研究表明sB7-H4是鉴别良性胸腔积液和恶性胸腔积液的一个有价值的肿瘤标志物并且sB7-H4与CEA联合检测胸腔积液的敏感性为90.91%，特异性为97.62%[14]。细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）作为T细胞活化的负性调节因子，与许多恶性疾病有着密切的关系。研究表明CTLA-4诊断恶性胸腔积液的敏感性和特异性分别为58.30%和83.30%，CTLA-4、CEA和CYFRA 21-1联合应用可使诊断敏感性提高到88.89%[15]。

因此早期进行肿瘤标志物检测对恶性浆膜腔积液的诊断有重要意义，多项指标联合应用可相互补充，从而提高良恶性浆膜腔积液鉴别诊断的敏感性和特异性。最新研究认为腹腔积液CEA对大肠癌患者的患腹膜癌几率和预后有一定的预测价值[16]。有学者对10836名乳腺癌妇女进行队列研究，发现术前检测CA15-3和CEA水平可能有助于预测乳腺癌的生存率，并为luminal A和基底样亚型患者提供个性化的治疗策略[17]。可见肿瘤标志物不仅辅助病理诊断，而且对恶性肿瘤的预后和治疗有重要意义。

3 DNA倍体分析

每个正常的体细胞核内有23对染色体，只有增殖期的细胞才会有染色体的复制。在生理状态下，人体绝大多数的细胞处于静止期，除生殖细胞外，染色体数均为二倍体，DNA含量恒定。当细胞处于G1/G0期时，细胞DNA指数为1或2C（二倍体细胞）;当细胞处于增殖期（G2/M期）时，DNA指数可倍增，表达为2或4C（多为四倍体细胞）。当细胞受到致癌物刺激或DNA损伤时，导致细胞基因突变或染色体畸形断裂，细胞增殖早期细胞核内出现DNA含量，结构及染色体数量改变，即产生单条或多条染色体，成为异倍体，最终发展为细胞形态异常和恶性肿瘤[18]。因此，DNA异倍体的出现是染色体异常变化的标志，对胸腹水中细胞进行DNA倍体分析，不仅可以观察正常细胞的周期变化，还可以及时发现恶性增殖的肿瘤细胞，可以用来鉴别诊断胸腹水的良恶性[19]。目前，把DNA倍体分析应用于细胞学的方法有两种：流式细胞术DNA倍体分析（flow cytometry，FCM-DNA）和细胞图像DNA倍体分析（image cytometry，ICM-DNA）。

3.1流式细胞术DNA倍体分析  先将积液制成单细胞悬液，然后加入DNA倍体分析试剂盒中的细胞膜穿透液，和PIN荧光染色剂，制成符合条件的细胞悬液，使用流式细胞仪进行DNA细胞周期分析（G0/G1，S、G2/M期）及DI测定。利用激光激发结合在细胞核内DNA上的荧光染料，通过自动收集并多参数综合作用，得到的荧光强度反映DNA的含量，以相对荧光强度做为横轴，以细胞数为纵轴，即可得到一个直方图[20]。测定结果以单参数直方图表示。FCM检测良、恶性浆膜腔积液的判断标准[21]：正常二倍体细胞的DI值为0.9～1.1，其余均为异倍体即为恶性;有一个突出的四倍体峰和大于15%的S期细胞，并伴有G0/G1期变异系数（CV）值大于9%为恶性;G0/G1期CV值增大，并伴有大于10%～15%的S期和一个突出的四倍体峰，为可疑恶性。有研究显示，用流式细胞术DNA倍体分析检测浆膜腔积液的灵敏度为78.6%，特异性为80.0%，准确性为79.2%，明显高于传统光学显微镜检查[22]。流式细胞术DNA倍体分析相对细胞学检查对诊断良恶性浆膜腔积液的灵敏度更高，可作为细胞学检查的补充[13]。但其也有一定的缺点：费用较昂贵，需要檢验技术较高，检测后样本不能保存并进行重复性检测，不利于临床普及。

3.2细胞图像DNA倍体分析  取浆膜腔积液标本液基制片，应用Feulgen染色法对细胞核染色，其中的Schiff试剂可与DNA分子特异性结合而着色，从而根据染色深浅及着色颗粒在核内分布等因素衡量DNA含量。细胞DNA定量分析系统可对每例标本中4000个以上细胞核进行自动聚焦，测定每个细胞核的132个核特征，自动进行细胞分类和计数，计算出细胞核的DNA倍体变化，确定是否有病变细胞及其所占比例。当DI值在1.1～1.9，2.1～2.8的细胞被认为是异倍体细胞，当异倍体细胞DI值在1.1～1.9形成峰值，或有3个以上细胞DI值>2.5（除外整倍体）;或细胞DI=2的细胞数占被测细胞总数10%以上时，即可诊断为恶性[23]。所有被检测细胞中DNA倍体异常细胞，必须由人工对每一个异倍体细胞进行仔细核实，以排除系统将重叠的细胞核或垃圾误认为异常细胞。有研究表明，在可疑性渗出液中，ICM-DNA的灵敏度可能高达87.5%，在恶性肿瘤的检测中，ICM-DNA优于流式细胞术[24]。也有研究表明细胞图像DNA倍体分析对恶性积液的诊断敏感性为88.3%，特异性为100%，是一种简单、实用、经济的恶性积液辅助诊断方法[25]。因此DNA倍体分析可作为浆膜腔积液良恶性分析的重要指标，其阳性结果可为以作为临床诊疗依据。与流式细胞术DNA倍体分析比较，细胞图像DNA定量分析具有细胞玻片可长期保存并重复检测、检测敏感性更高、操作简单且人为因素影响小、价格适中、利于临床普及等优点。

4免疫组织化学

免疫组织化学是组织病理学最常用的辅助诊断技术，可以帮助判断肿瘤的良恶性、组织来源及组织学亚型。近几年越来越多的研究集中在把免疫组织化学应用于细胞学上。常用免疫细胞化学（ICC）检测的抗体有：上皮源性标记CK（Pan）、EMA、MOC-31、BerEP4等;间皮细胞标记CK5/6、WT-1、Calretinin、HBME-1、MC和D2-40等;淋巴细胞来源标记LCA、CD3、CD20等;肺源性肿瘤CK7、TTF-1、NapsinA等;卵巢来源PAX-8、CK7、CA125、WT-1等;乳腺源性GATA3、GCDFP-15、Mammaglobin、E-cadherin等;胃肠道来源CEA、CDX-2、CK20等。目前为止没有一种抗体对间皮或上皮细胞完全敏感或特异，在判断每种细胞来源中，至少需两种抗体联合应用。解建军等[26]研究得出D2-40、Calretinin、MOC-31和CEA四种抗体联合应用，对于间皮性病变和转移腺癌诊断的灵敏度和特异度分别达到99.2%和100.0%，远远高于任何一种抗体的单独应用或其他抗体的组合应用，可作为一线抗体联合应用。目前为止把免疫组织化学应用于细胞学主要有三种方法：①细胞涂片退染后，行ICC染色;②同时制备多张涂片进行ICC染色;③细胞块加ICC染色。

4.1细胞涂片退染  经HE染色的涂片清除盖玻片，置入二甲苯中脱胶，梯度乙醇（从高浓度至低浓度）水化，蒸馏水洗涤;1%的盐酸乙醇浸泡3 min，水洗后待用做ICC。赵银环等[27]通过利用唇膏和金刚笔正反划分区域在细胞HE涂片褪色后做ICC标记，最多可以用八分格在一张涂片上做8项ICC染色，其定位准确。但是常规涂片做ICC时，常会出现背景深、非特异性着色、出现假阳性，易掉片等缺点，因此操作有一定难度。

4.2制备多张涂片行ICC染色  在薄层液基制片的基础上行ICC染色，同一标本可制作多张涂片，一张用于HE染色，其余用于ICC染色，先存于-20℃冰箱备用。根据HE病变特点判断ICC的抗体的选择。与常规涂片相比，液基制片具有背景清晰，细胞分布均匀，厚薄一致，且同一标本可制作多张涂片，便于抗体组合应用。赵乐通过研究发现应用薄层液基涂片及ICC相结合方法，采用CR、HMBE-1、WT1、CDX2、E-cadherin、GLUT1六种抗体组合应用对胸腹水中腺癌细胞与增生间皮细胞鉴别诊断很有帮助[28]。但由于液基制片后，每张切片细胞的种类和分布会有所差异，可致使抗体的选择应用准确率降低。

4.3细胞块加ICC技术  对胸腹腔积液进行离心，然后取沉淀物包埋，对于肉眼有凝集物者可直接包埋，然后脱水，石蜡包埋成细胞块。与传统涂片制片相比，细胞块切片HE染色提供了更好的与组织学非常相似的形态结构，从而提高了细胞诊断的敏感性[29]。细胞蜡块能长期保存及重复使用，可以继续做ICC及基因检测，更能有效满足临床诊断和确定治疗方案的要求。细胞蜡块联合ICC可以连续多张切片，有利于多种抗体组合运用;背景干净，细胞集中，定位准确，可重复性高;可以帮助细胞分型，降低了漏诊率。细胞块结合ICC技术明显提高了胸水恶性肿瘤的检出率，同时为靶向治疗尤其是腺癌的分子遗传学分析提供了材料[30]。Woo CG等[31]研究得出常規应用细胞蜡块和CEA染色结合液基细胞学可提高恶性胸腔积液诊断的敏感性和特异性，提高诊断的准确性。

林梅英等[32]研究认为细胞蜡块检测虽具有可重复性和可长期保存的优点，但在实际工作中常会遇到细胞数量少或者难以发现涂片中可疑细胞团的情况，这时就需要使用涂片褪色后行免疫组化染色的方法帮助诊断。因此以上3种方法可以互相配合使用，能够提取细胞蜡块的标本首选细胞蜡块结合ICC诊断，若细胞沉渣过少，推荐同时应用传统涂片或TCT退染两种方法，以提高阳性率[33]。

5分子病理

随着分子病理学的发展，使得恶性浆膜腔积液患者尤其是晚期不能进行手术的患者的对症治疗得以实现。细胞蜡块成为能进一步进行分子检测，明确治疗方案，判断预后，可进行回顾性研究的材料。现就目前常用的分子检测技术总结如下。

5.1 FISH技术  是利用已知核酸序列制备探针，先以非放射性物质标记或用荧光素直接标记探针，探针与靶DNA进行杂交，再通过免疫细胞化学反应连接上荧光素标志物，然后在荧光显微镜下观察杂交信号，对标本中待测核酸进行定性、定量和定位分析的方法。有学者用FISH检测了137例NSCLC患者胸腔积液细胞蜡块间变性淋巴瘤激酶（ALK）基因重排情况，结果有11.7%发生了ALK重排，认为FISH检测细胞学标本中的ALK基因重排是筛选NSCLC适合靶向治疗晚期患者的敏感方法[34]。

5.2 RT-PCR  逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）通过逆转录（RT）将RNA转化为cDNA，然后通过聚合酶链式反应（PCR）扩增cDNA。常见应用包括表达基因检测、转录物变异检测，以及克隆和测序用cDNA模板制备。Nakamichi S等[35]采用RT-PCR方法对肺癌患者的细胞学标本进行间变性淋巴瘤激酶（ALK）易位分析，发现3%阳性，RT-PCR阳性的4份标本同时进行IHC和FISH检测，均为阳性，认为RT-PCR是检测原发性肺癌细胞ALK易位的一种有效方法。ALK抑制剂克唑替尼和阿来替尼均可用于晚期ALK阳性非小细胞肺癌患者的一线治疗，客观缓解率和无进展生存时间显著优于含铂化疗，并改善患者的生活质量[36]。

5.3第二代测序（NGS）  利用高保真DNA聚合酶生成与单链DNA模版互补的拷贝。在每个反应中，一个可以特异性识别模版的单链引物，可以从3端开始启动DNA合成，根据碱基互补配对原则，脱氧核糖核苷酸或简单的核苷酸是一个接一个的与模版配对。Gornjec A等[37]用第二代测序-NGS法研究输卵管卵巢高级别浆液性癌BRCA1/2基因突变中发现细胞学和组织学标本BRCA1/2突变检测结果一致性为100%，具有足够比例肿瘤细胞的细胞学标本可用于HGSC患者BRCA1/2基因突变分析，并能更快地处理基因分型，而BRCA突变的患者可以用聚（ADP-核糖）聚合酶抑制剂（PARPI）治疗。

6总结

对良恶性浆膜腔积液的诊断及鉴别诊断是细胞学研究的重点课题，单靠一项指标对恶性浆膜腔积液的诊断都存在误诊和漏诊的问题，为提高对恶性浆膜腔积液的诊断率，一般提倡多项指标联合检测并综合分析。因此在细胞学检测作为基础，联合肿瘤标志物检测、DNA倍体分析，细胞蜡块和免疫组化多项指标联合检测可达到提高诊断准确率的目的。分子技术的发展有效指导了肿瘤的分子靶向治疗，为恶性肿瘤患者提供了一条新的诊断和治疗途径。

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收稿日期：2020-03-16;修回日期：2020-04-15

编辑/成森

作者简介：梁海红（1981.10-），女，河北肃宁人，硕士，主治医师，主要从事肿瘤的病理诊断工作