基于适配体银纳米粒子比色传感测定As(Ⅲ)的研究

2020-07-27陈倩倩顾翔源杨泽怡陆姗姗朱颖越

分析科学学报 2020年3期

陈倩倩，顾翔源，杨泽怡，张瑞，陆姗姗，朱颖越

(常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500)

砷属于过渡性元素，单质砷毒性很小，但砷化物均有毒性[1]。砷和砷化物主要应用于合金材料、半导体材料，木材防腐剂、杀虫剂、除草剂，医药领域。砷及其化合物主要以食物、空气和饮用水等方式进入人体，且常以As(Ⅲ)和As(Ⅴ)的形态存在于地下水中[2]，而As(Ⅲ)的毒性最强[3,4]。由于砷在体内代谢较慢，长时间蓄积在体内会引起各个器官和系统的异常和病变[5]，且有机砷会破坏人体DNA，并引发癌症[6，7]。因此，对检测As(Ⅲ)新方法的研究具有重要的现实意义。

目前检测砷的方法主要有银盐法、砷斑法、原子荧光光谱法[8]、原子吸收光谱法[9]、电感耦合等离子体发射光谱法[10]、电感耦合等离子体质谱法[11，12]等。上述方法都有很高的灵敏性和准确性，但是所需仪器昂贵，检测过程繁琐、成本高，前处理过程时间较长，不适用于现场快速检测。所以研究一种简便高效、精密度高的检测As(Ⅲ)的方法具有很大前景。

近年来，有不少研究表明，基于核酸适配体的生物传感技术对As(Ⅲ)具有良好的检测效果，其作为一种新型检测方法具有简单快捷、成本低、亲和力高、特异性强等优点[13,14]。本文基于盐诱导下核酸适配体与银纳米粒子(AgNPs)相互作用，通过研究其特定波长下吸光度的比值A650/A420与As(Ⅲ)浓度的变化关系实现对As(Ⅲ)的检测。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

旋涡振荡器(美国，Scientific Industries公司)；密理博超纯水仪(北京普析通用公司)；Lambda 25紫外-可见分光光度计(美国，Perkin Elmer公司)；磁力加热搅拌机(金坛市杰瑞尔电器有限公司)；电子天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司)。

As(Ⅲ)、Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)的标准液均购自于国家标准物质中心；核酸适配体序列为：5′-TTACAGAACAACCAACGTCGCTCCGGGTACTTCTTCATCG-3′，购于上海生工公司；AgNO3、二水合柠檬酸三钠、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均为分析纯，购买于江苏强盛功能化工股份有限公司。实验用水为超纯水(>18 MΩ·cm)。

1.2 银纳米粒子的合成

将100 mL超纯水配制的0.01%AgNO3溶液装入锥形瓶中，加入磁力搅拌子，置于恒温电磁搅拌器上加热，沸腾持续2 min后迅速加入2.5 mL质量分数为1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌加热至溶液变为淡黄色，生成银纳米粒子(AgNPs)，继续加热10 min后停止加热，搅拌使其冷却至室温，放置在4 ℃环境中贮存，备用。

1.3 实验原理

银纳米粒子在盐诱导下会发生聚集，引起体系吸光度有明显的改变。体系中的NaCl与核酸适配体在一定条件下能维持平衡时，吸光度保持不变。原理如图1所示，当不存在As(Ⅲ)时，核酸适配体吸附包裹在AgNPs表面，性质稳定，在盐溶液中呈分散状态，溶液颜色为黄色[15]；当存在As(Ⅲ)时，核酸适配体从AgNPs上脱离下来，与As(Ⅲ)结合形成复杂的配合物，使AgNPs暴露在盐环境中[16]，从而导致AgNPs聚集，溶液颜色由黄色变为灰色，吸光度和特征峰位置均发生改变。基于此原理建立的新型生物传感器可实现对As(Ⅲ)的快速检测。

图1 比色传感器检测As(Ⅲ)原理图Fig.1 Schematic illustration of the colorimetric sensor for As(Ⅲ)

1.4 实验方法

向2 mL离心管中，先加入500 μL的AgNPs溶液，再加入30 μL用缓冲液(20 mmol/L的Thris-HCl,pH=7.4)配制好的核酸溶液，使其最终体系浓度为1.5 nmol/L，然后在45 ℃恒温水浴加热3 min后，加入65 μL NaCl溶液，使其最终体系浓度为32.5 mmol/L，其次加入一系列不同浓度的As(Ⅲ)溶液，最后用超纯水定容至2 mL。混匀振荡后，反应10 min，用紫外-可见分光光度计，在波长300～700 nm范围进行光谱扫描。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

本实验是利用NaCl、As(Ⅲ)与核酸适配体的竞争关系实现对AgNPs的可控聚集，所以NaCl和核酸适配体的量直接影响整个检测体系的性能。由图2(a)可知，AgNPs在分散状态下于420 nm有最大吸收峰，聚集状态下于650 nm有最大吸收峰，所以用A650/A420反映AgNPs从分散到聚集的变化情况。从图中可以看到，当NaCl浓度为32.5 mmol/L时，A650/A420比值最大，AgNPs聚集程度最大，NaCl浓度再增加时，A650/A420比值不变，故选择NaCl的最佳浓度为32.5 mmol/L；同理，当核酸浓度为1.5 nmol/L时，A650/A420比值最小，AgNPs分散程度最大，故选择核酸最佳浓度为1.5 nmol/L。

图2 实验参数浓度优化Fig.2 Optimization of the relevant experimental factors

2.2 As(Ⅲ)砷标准曲线的建立

在实验优化好的条件下，在该体系加入一系列不同浓度梯度的As(Ⅲ)溶液，用紫外-可见分光光度计进行光谱扫描，以A650/A420比值和As(Ⅲ)浓度建立标准曲线。由于As(Ⅲ)与其适配体之间的结合力大于核酸适配体与AgNPs表面的电荷吸附效应，所以随着As(Ⅲ)浓度的增加，AgNPs会暴露在盐环境中，聚集程度越来越明显，A650/A420比值也越来越大，溶液颜色由棕黄色变为淡黄色。由图3可知，As(Ⅲ)浓度在5～100 ng/mL范围内与A650/A420比值呈良好的线性关系，线性方程为：Y=0.20702+0.00705X，相关系数R2=0.9937，检测限可达4 ng/mL。

图3 AgNPs随As(Ⅲ)浓度变化的吸收光谱Fig.3 Absorption spectrum of silver nanoparticles varying with As(Ⅲ) concentration(Inset:culibration of As(Ⅲ)

2.3 特异性分析

为检测该方法的特异性，在体系中加入浓度为100 ng/mL的不同金属离子Cu(Ⅱ)、Mn(Ⅱ)、Zn(Ⅱ)、Fe(Ⅲ)，进行光谱扫描并观察颜色变化。如图4所示，通过分析比较，As(Ⅲ)使整个体系颜色变化最明显，由棕黄色变为淡黄色，且A650/A420比值最大，其他体系颜色变化均不明显，表明此方法对As(Ⅲ)有良好的识别能力。