废水中Hg2+快速检测试纸条研制

铁文利，王 莉，李春光，彭赵旭

(1.郑州大学生态与环境学院，河南郑州 450001；2.郑州航空工业管理学院环境功能材料重点实验室，河南郑州 450015)

汞作为一种全球性污染物，具有高毒性、高迁移性、不可降解性、生物富集性和食物链放大性等特性[1]。目前检测Hg2+的主要方法有：原子吸收法[2]、原子荧光光谱法[3]、高效液相色谱法和电感耦合等离子体发射光谱法[4 - 6]等。近年来，出现了很多检测Hg2+的新方法，如以各种荧光物质[7]、金纳米粒子[8]、有机分子[9]、DNA酶[10]等为基础的传感器方法。这些方法灵敏度较高，但是存在预处理复杂、费时和易受其他金属离子影响等缺点。因此，探索一种简便、灵敏且快速的Hg2+检测方法迫在眉睫。

DNA适配体具有亲和力大、特异性强、制备方便、易于合成和长期保存等优势，可以和小分子物质、药物、蛋白质、抗生素等不同的靶标进行高特异性和高亲和力的结合[11 - 13]。CeO2是一种重要的稀土氧化物，它具有超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、磷酸酶、过氧化物酶和氧化酶等模拟酶活性[14 - 16]，具有广泛的应用前景，尤其在水体污染物降解处理和检测方面备受关注。但目前还未见到将CeO2应用于Hg2+快速检测的相关研究。

本研究利用纳米CeO2和DNA适配体，构建了一种新型的Hg2+检测技术。方法检测原理如图1所示。CeO2材料具有生物酶性质，它能将四甲基联苯胺(TMB)显色液氧化为蓝色产物。适配子溶液中的Tris可以促进核酸的溶解，牛血清白蛋白(BSA)可以保护偶联物以降低非特异性识别，复溶液则可以促进偶联物稳定结合和增加标记物与膜的亲水作用，避免显色条内出现中空，同时其中含有的MgSO4可以促进待测物与适配子核酸片段的结合。在配制好的Hg2+DNA适配体溶液中加入纳米CeO2材料，该材料与DNA适配体结合，使材料发生钝化，此时若向溶液中加入TMB，溶液将显无色；当向溶液中加入含Hg2+的溶液，Hg2+DNA适配体与Hg2+结合，释放出CeO2，与TMB反应重新显蓝色。构建的方法具有操作简单、反应快速、灵敏度高等特点，在实际应用中有较大潜力。

图1 试纸条检测原理示意图Fig.1 Schematic diagram of the detection principle of strip

1 实验部分

1.1 主要仪器及试剂

通过Empyrean型X射线衍射仪(XRD，荷兰PANalytical公司)对样品的物质组成和内部空间结构进行分析检测。通过JSM-IT100型扫描电子显微镜(SEM，日本电子株式会社)观察样品的表面形貌。LRH系列生化培养箱(上海一恒科技有限公司)；TGL-18C高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；KQ 3200B超声波清洗器(昆山市国华电器有限公司)；DHG -9070A电热鼓风干燥箱(上海精密实验设备有限公司)；85-2磁力加热搅拌器(常州普天仪器制造有限公司)。

Tris-HCl、Ce(NO3)3·6H2O、聚乙二醇20000(PEG20000)、牛血清白蛋白(BSA)、吐温-20(Tween-20)(翊圣生物)；L-天冬酰胺(源叶生物)；四甲基联苯胺(TMB显色液)(博特森生物)；链酶亲和素(>95%，北京索莱宝科技有限公司)；硝酸纤维素膜(NC膜)(JY BIOTECH)；Hg2+DNA适配体、Probe1 Hg2+(金唯智生物科技有限公司)；HgCl2(姜堰市环球试剂厂)。磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH=7.4)：称取0.0675 g KH2PO4、0.895 g Na2HPO4·H2O、2.0 g NaCl和0.5 g KCl，用超纯水配制成250 mL溶液，浓度为0.01 mol/L。适配子溶解液：在0.6057 g Tris、0.819 g NaCl和9.522 mg MgCl2中加入少量超纯水，溶解后加入42 mL 0.9%稀HCl，定容至1 000 mL。偶联物复溶液：将5 g蔗糖、0.5 g PEG20000、1 g BSA和0.5 g Tween-20溶于超纯水，定容至1 000 mL。链酶亲和素溶液:链酶亲和素干粉中加入1 mL PBS，得到1 mg/mL的链酶亲和素溶液。所用试剂均为分析纯，实验用水均为超纯水。

1.2 纳米CeO2的制备

本文采用水热法制备中空球状纳米CeO2材料。将1.17 g Ce(NO3)3·6H2O，4.50 g KBrO3和1.20 g L-天冬酰胺充分溶解。将上述溶液倒入聚四氟乙烯反应釜中，于140 ℃的烘箱中反应24 h，将生成物转移至20 mL的离心管中，用超纯水和无水乙醇交替反复洗涤干净后，置于恒温培养箱中65 ℃恒温干燥12 h，即得到纳米CeO2材料。

1.3 检测线和质控线溶液的制备

试纸条上用于检测Hg2+的指示线即为检测线。Hg2+DNA适配体干粉用高速离心机离心(5 000 r/min) 5 min后，加入40 μL 适配子溶解液和偶联物复溶液，振荡10 min使其充分溶解。移取40 μL上述溶液于1.5 mL离心管内，并加入40 μL链酶亲和素溶液，摇匀后将溶液在4 ℃条件下静置2 h。加入20 μL PBS(0.01 mol/L)，并加入定量的纳米CeO2材料，在4 ℃条件下静置12 h，得到检测线溶液。质控线溶液同检测线的制备方法一样，但所用的DNA适配体是不具有专一选择性的Probe1 Hg2+适配体，即质控线对溶液中的Hg2+不能专一检测，用以对比检测线的颜色变化。

1.4 实验操作

(1)NC膜的处理:将NC膜修剪成均匀的长条状，在恒温干燥箱中于37 ℃下干燥1 h后，在1%的BSA中培育30 min，用pH=8.8四硼酸钠缓冲溶液洗涤至少3次，再将试纸条在37 ℃下干燥3 h。

(2)划线:分别将质控线和检测线溶液吸入移液枪中，均匀划线于NC膜上，于37 ℃干燥箱内烘干30 min。

(3)显色:将NC膜在1 μg/mL的Hg2+溶液中完全浸润后，烘干10 min。滴加TMB显色液于质控线和检测线，避光显色60 s左右，记录质控线和检测线的颜色变化。

2 结果与讨论

2.1 CeO2材料的制备与表征

对制备的纳米CeO2进行扫描电子显微镜(SEM)检测，如图2所示。制备的纳米CeO2材料为中空球状结构，这种结构的材料比表面积大，吸附能力强，有利于接触和吸附待测物质。最终制得的淡黄色物质，即是所要制备的中空球状纳米CeO2材料。采用水热法制得的纳米CeO2具有纯度高、粒径小且分布均匀等特性，产率可稳定在75%左右。

图2 纳米CeO2材料样品的扫描电镜(SEM)图Fig.2 SEM image of nano -cerium oxide samples

对纳米CeO2材料进行X射线衍射(XRD)分析，如图3所示。可以看到，制备的CeO2在2θ=28.57°、33.63°、47.23°、56.89°有四个明显的特征峰，与PDF标准卡相对照，这四个峰的锋形尖锐，峰强度较大，结晶度较好，可见制备的纳米CeO2较好，纯度较高。

图3 纳米CeO2材料的X射线衍射(XRD)分析Fig.3 XRD analysis of nano -cerium oxide samples

2.2 纳米CeO2材料酶活性分析检测

称取三份50 mg纳米CeO2材料，分别置于A、B、C三个1.5 mL离心管内，移取1.5 mL、1 mL、1 mL超纯水分别加入离心管A、B、C内。摇匀后，再向B、C内各加入0.5 mL的TMB显色液，然后避光静置一段时间后，观察离心管中溶液颜色。这时，再向C管中滴入一滴稀H2SO4，观察离心管C中的溶液颜色变化。

向B、C离心管内加入TMB显色液后可观察到，离心管B、C中溶液均变蓝。向C管中滴入一滴稀H2SO4，观察到离心管C中的溶液由蓝色变为黄色，如图4所示。可知本实验制得的纳米CeO2材料具有生物模拟酶活性，从而使CeO2与TMB显色液显蓝色；又由于H2SO4终止液的加入，一方面破坏了纳米CeO2酶的活性，使酶的催化功能丧失；另一方面溶液pH降低，蓝色的阳离子根转变为黄色的联苯醌，使反应终止显黄色。

图4 纳米CeO2材料酶活性分析检测结果Fig.4 Results of enzyme activity analysis of nano -cerium oxide samples

2.3 实验条件的优化

2.3.1 CeO2浓度的选择配制5组CeO2浓度为4 mg/mL、7 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL的质控线和检测线溶液，按照显色条件进行优化。当CeO2浓度为10 mg/mL时，检测线和质控线颜色就比较明显，如图5所示。即选用CeO2溶液浓度为10 mg/L为最优浓度。

图5 纳米CeO2浓度的优化Fig.5 Optimization of nano -cerium oxide concentration

2.3.2 DNA适配体浓度的选择配制Probe1 Hg2+浓度为100 μmol/L的质控线溶液，和Hg2+DNA适配体浓度为25、50、75、100 μmol/L的四组检测线溶液，进行优化实验。从图6可见，当Hg2+DNA适配体浓度为25 μmol/L时显色效果最好，因此选用Hg2+DNA适配体浓度为25 μmol/L。

图6 DNA适配体浓度的优化Fig.6 Optimization of DNA aptamers concentration

2.4 试纸条的专一性实验

配制最适浓度的检测线溶液和质控线溶液，与Cd2+、Ni2+、Cr3+干扰离子溶液进行专一性实验。同时配制20倍量的干扰离子溶液进行实验，并测其吸光度。试纸条专一性实验显色结果如图7所示，检测Cd2+、Ni2+、Cr3+的试纸条中的检测线不显色，而质控线因不具有专一性而显色。说明这几种离子不能与Hg2+DNA适配体特异性结合，从而不能释放纳米CeO2与TMB发生反应，且干扰允许量不低于20倍量。证明纳米CeO2材料制作的试纸条检测Hg2+具有专一性。

图7 试纸条专一性试验Fig.7 Specificity of the strip

将测得的吸光度绘出条形图。由图8可分析，检测到Hg2+的一组吸光度数值远大于其它金属离子，验证该检测技术对Hg2+的专一性较好。

图8 专一性检测验证Fig.8 Specificity verification of the strip

3 结论

(1)采用水热法制备出中空球状的纳米CeO2材料，并用TMB显色液对纳米CeO2材料的生物酶活性进行了检测分析，检测出所制得的纳米CeO2材料具有生物酶活性；(2)纳米CeO2材料和Hg2+DNA适配体制作的试纸条可用来检测废水中的Hg2+，且在纳米CeO2材料的浓度为10 mg/mL，Hg2+DNA适配体的浓度为25 μmol/L时检测效果最佳；(3)通过试纸条对水中Cd2+、Ni2+、Cr3+的检测和吸光度分析，得出利用纳米CeO2材料和Hg2+DNA适配体制作出的试纸条对水中Hg2+的检测具有专一性；(4)试纸条在检测过程中颜色梯度不够明显，反应颜色保持时间短。在后续实验中将进一步优化实验条件，继续研究更多铈基材料的合成与性能，找出Hg2+试纸条最佳的研制方法，以实现在实际中的应用。