硫化铜-磷酸钙纳米载体的制备及光热性能研究

2020-07-27田利霞包志红郑佳妮

中国药剂学杂志(网络版) 2020年4期

田利霞, 包志红, 郑佳妮, 袁悦

（沈阳药科大学药学院, 辽宁沈阳 110016）

癌症已成为威胁人类生命的重大疾病之一[1-2]。近几年兴起的肿瘤的光热疗法是使用低毒的光热治疗材料，利用靶向识别技术将其聚集到肿瘤组织部位，在外部光源照射下将光转化为热，进而杀死癌细胞[3-5]。光热治疗在有效杀伤恶性肿瘤细胞的同时，给患者带来的并发症和不良反应相对较少。为了提高治疗效果，避免单一光热疗法在癌症治疗方面的不足，光热疗法结合药物疗法所构建的多功能纳米治疗平台逐步成为科学界研究的主要方向之一[6-7]。硫化铜（CuS）纳米粒子在近红外区域（700～1 100 nm）的生物窗具有良好的光吸收效应，同时具有优异的生物相容性和低毒性，成为光热治疗的绝佳纳米材料[8-9]。磷酸钙广泛存在于自然界，是人体骨骼和牙齿的重要组成成分，它也是一种重要的pH响应药物递送载体材料。

作者采用模板法将具有光热转换性能的硫化铜纳米粒子包载到具有载药性能的磷酸钙纳米粒子中，并对制备出的复合材料进行光热性能的初步评价。该研究为实现肿瘤治疗载体的构建提供了实验基础。

1 仪器与材料

DF-101Z集热式恒温加热磁力搅拌器（巩义予华仪器有限公司），ME104E电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），Z90马尔文激光粒度仪（英国Malvern公司），756PC紫外可见分光光度计（上海舜宇恒平科学仪器有限公司），KQ-100DB数控超声仪（昆山超声仪器有限公司），HC-2516高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司），D/max200PC X射线衍射仪（德国Bruker公司），LE-LS-808-TFC 808 nm近红外激光器（深圳理欧光电科技有限公司），DZF-6020真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），Nicolet6700傅里叶变换红外光谱仪（美国Nicolet公司），H-7500透射电镜（日本日立电子株会社）。

聚丙烯酸（相对分子质量1 800，PAA）（含量质量分数98.2%，美国Sigma公司），氯化铜（CuCl2，含量质量分数99%，北京伊诺凯科技有限公司），硫化钠（Na2S·12H2O，含量质量分数95%，北京伊诺凯科技有限公司），氢氧化钙（Ca(OH)2，分析纯，北京国药化学试剂有限公司），磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O，分析纯，天津大茂化学试剂有限公司），磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O，分析纯，天津大茂化学试剂有限公司），磷酸氢二铵（(NH4)2HPO4，分析纯，天津大茂化学试剂有限公司），磷酸二氢铵（NH4H2PO4，分析纯，天津大茂化学试剂有限公司），异丙醇（分析纯，天津富宇精细化工公司）。

2 方法与结果

2.1 PAA/CuS-CaP NCs的处方工艺筛选

室温下，分别将56 mg CuCl2加入到200 mL去离子水中搅拌溶解，在搅拌条件下加入60 mg聚丙烯酸，反应30 min后慢慢滴加用少量水溶解的100 mg Na2S·12H2O的溶液，分别在60 ℃反应2 h、60 ℃反应12 h、90 ℃反应15 min三种条件下进行合成，反应结束后将反应液放入冰水中冷却，最后置于4 ℃条件下保存[10-13]。取适量三种PAA/CuS-CaP NCs样品，用去离子水稀释后，采用Malvern Nano ZS 90动态光散射粒度测定仪对纳米粒的粒径和Zeta电位进行测定。测定条件：测定温度25oC，检测角度90o，平衡时间120 s。

Table1 Particle sizes and potentials of PAA/CuS NPs under different reaction conditions 表1 不同反应条件下PAA/CuS NPs的粒径大小及电位值

测定结果见表1，60 ℃反应12 h得到的PAA/CuS NPs粒径较小，大小均一，利于接下来的PAA/CuS-CaP NCs的制备，因此我们将采取反应温度为60 ℃、反应时间为12 h作为PAA/CuSNPs的合成条件。PAA/CuS NPs的Zeta电位为-(18.2±0.59) mV，说明PAA/CuS NPs中起稳定作用的羧酸根有剩余，可以与钙离子形成磷酸钙，为下一步合成打下基础。

2.1.1 PAA/CuSNPs的最佳处方

室温下，分别将56 mg CuCl2加入到200 mL去离子水中搅拌溶解，在搅拌条件下加入60 mg聚丙烯酸，反应30 min后慢慢滴加用少量水溶解的100 mg Na2S·12H2O的溶液，60 ℃反应2 h，反应结束后将反应液放入冰水中冷却，最后置于4 ℃条件下保存。

2.1.2 傅里叶红外光谱（FT-IR）分析

以PAA作为对照，采用傅里叶红外光谱分析法表征PAA/CuS NPs，结果见图1，谱图a为PAA，谱图b为PAA/CuS NPs。谱图a与谱图b在1 708.6 cm-1处均出现了明显的特征吸收峰，归属于PAA羰基的伸缩振动。因此，可以确定在PAA/CuS NPs中有PAA的存在。

Fig.1 FTIR spectra of PAA (a) and PAA/CuS NPs (b) 图1 PAA (a)和PAA/CuS NPs (b)的红外光谱图

2.2 PAA/CuS-CaP NCs的处方筛选

2.2.1 反应时间的筛选

室温下，将3.6 mg Ca(OH)2加入至40 mL上述制备的PAA/CuS NPs水溶液中超声溶解，搅拌30 min至溶液变澄清，再向该混合液滴加240 mL的异丙醇，滴加完毕后加入11.60 mg Na2HPO4·12H2O，分别反应2、4和12 h。从图2可以看出反应4和12 h后PAA/CuS NPs专有的绿色减弱很多，而反应2 h的产物依然保有很深的绿色。分别取三种不同反应时间制备的PAA/CuS-CaP NCs水溶液，进行紫外-可见-近红外光谱扫描，得到不同反应时间PAA/CuS-CaP NCs的UV-Vis-NIR光谱。从图3中可以看出反应时间为2 h制得的PAA/CuS-CaP NCs保留了CuS NPs在700～1 100 nm之间吸收峰，而反应4和12 h 制备的PAA/CuS-CaP NCs在此区间的吸收峰很弱。为了满足材料进一步的光热转换的应用，将制备PAA/CuS-CaP NCs时反应时间设定为2 h。

Fig.2 The experiment phenomenon at different reaction times for PAA/CuS-CaP NCs 图2 PAA/CuS-CaP NCs不同反应时间的实验现象

Fig.3 The UV-Vis-NIR spectra of PAA/CuS-CaP NCs at different reaction times 图3 不同反应时间PAA/CuS-CaP NCs的UV-Vis-NIR光谱图

2.2.2 磷酸盐的筛选

室温下，将3.6 mg Ca(OH)2加入至40 mL PAA/CuS NPs水溶液中超声溶解，搅拌30 min至溶液变澄清，再向该混合液滴加240 mL的异丙醇，滴加完毕后加入相应处方量的Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、(NH4)2HPO4和NH4H2PO4，反应2 h，最后10 000 r·min-1离心10 min以收集纳米粒产物，计算制备PAA/CuS-CaP NCs的产率。

Table2 The effect of different phosphate source on the yieldof PAA/CuS-CaP NCs (n=3) 表2 不同种类磷酸盐对PAA/CuS-CaP NCs产率的影响(n=3)

从表2可知，使用二氢类磷酸盐NaH2PO4·2H2O和NH4H2PO4时PAA/CuS-CaP NCs的产率较低，这可能是因为二氢类磷酸盐增加了体系的酸性，PAA/CuS-CaP NCs在酸性条件下不宜生成。一氢类磷酸盐Na2HPO4·12H2O和(NH4)2HPO4生成的PAA/CuS-CaP NCs产量较高，本实验中将采用Na2HPO4·12H2O作为磷酸根来源。

2.2.3 PAA/CuS NPs水溶液和异丙醇比例的筛选

室温下，将3.6 mg Ca(OH)2加入至40 mL PAA/CuS NPs水溶液中超声溶解，搅拌30 min至溶液变澄清，再向该混合液分别滴加80、120、160、200、240和280 mL的异丙醇（即PAA/CuS NPs水溶液和异丙醇的体积比分别为1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6和1∶7），滴加完毕后加入11.60 mg Na2HPO4·12H2O，反应2 h，最后于10 000 r·min-1离心10 min以收集纳米粒产物。

分别取适量PAA/CuS-CaP NCs样品，用去离子水稀释后，采用Malvern Nano ZS 90动态光散射粒度测定仪对纳米粒的粒径进行测定。测定条件：测定温度25oC，检测角度90o，平衡时间120 s。测定结果见表3。

由表3可知，随着异丙醇加入比例的增加，PAA/CuS-CaP NCs的粒径越来越小，PAA/CuS NPs水溶液和异丙醇的体积比为1∶6时粒径最小，再增大异丙醇的用量，PAA/CuS-CaPNCs的粒径反而增大。这可能是因为当溶剂的量增加时，纳米粒间距更大，碰撞聚集的几率小，而体积比增大到1∶7时异丙醇可能会除去PAA/CuS NPs表面的稳定剂PAA，使PAA/CuS-CaP NCs重新组装变大，因此最终确定PAA/CuS NPs水溶液和异丙醇的体积比为1∶6。

2.2.4 PAA/CuS-NCs的最佳处方

通过单因素考察反应时间、磷酸盐的种类、PAA/CuS NPs水溶液和异丙醇的比例对纳米粒制备的影响，确立了PAA/CuS-CaP NCs最佳制备条件：3.6 mg Ca(OH)2，40 mL PAA/CuS NPs水溶液，异丙醇用量为240 mL（水-异丙醇体积比为1∶6），选择11.60 mg的Na2HPO4·12H2O作为磷酸根来源，最终制备出粒径为(146.43±1.6) nm的PAA/CuS-CaP NCs。此制备方法简单易操作，制备的纳米载体粒径均匀。

2.2.5 PAA/CaP NPs的制备

取200 μL PAA，加入到20 mL去离子水中，称取12 mg Ca(OH)2加入到上述溶液中，超声30 min，搅拌溶解完毕，量取40 mL异丙醇在磁力搅拌下滴加到上述反应中，滴加完毕，称取44.8 mg的Na2HPO4·12H2O加入到上述反应中，反应12 h，产物转移到离心管中，在8 000 r·min-1离心8 min，用去离子水洗3遍，再复溶于适量水中待用[14]。

2.2.6 X-射线粉末衍射（XRD）分析

为了验证PAA/CuSNPs是否被磷酸钙CaP包覆，分别对PAA/CuS NPs、PAA/CaP NPs和PAA/CuS-CaP NCs进行X-射线粉末衍射分析。取预先制备的PAA/CuS NPs、PAA/CuS-CaP NCs、PAA/CaP NPs烘干品，设定衍射角度5°～60°，递增0.04°，扫描速率为1°·min-1进行扫描，获得3种样品的XRD图谱。

Fig.4 XRD patterns of PAA/CuS NPs, PAA/CaP NPs and PAA/CuS-CaP NCs 图4 PAA/CuS NPs、PAA/CaP NPs and PAA/CuS-CaP NCs的XRD谱图

如图4所示，在测试的范围内，PAA/CuS NPs在2θ=31.7°左右出现明显的结晶峰，而PAA/CuS-CaP NCs、PAA/CaP NPs没有出现明显的结晶峰，但是在2θ = 30°左右，出现无定型的特征凸起，证明所制备的PAA/CuS-CaP NCs、PAA/CaP NPs中的磷酸钙为无定型磷酸钙，PAA/CuS-CaP NCs与PAA/CaP NPs的大部分衍射峰保持一致，表明PAA/CuS NPs被CaP包裹后，特征峰消失，验证了CaP对PAA/CuS NPs的包裹，同时包埋PAA/CuS NPs后的CaP依然保持自身特性。与羟基磷灰石相比，无定型磷酸钙作为一种磷酸钙材料广泛存在于骨骼中具有优越的生物相容性，同时有着更好的生物活性，可降解性。

2.2.7 粒径及电位分析

采用动态光散射粒度测定仪对PAA/CuS-CaP NCs的粒径和Zeta电位进行测定。粒径和电位结果如表4所示，PAA/CuS-CaP NCs的平均粒径为(146.43±1.62) nm，Zeta电位结果显示，PAA/CuS-CaP NCs的Zeta电位为-(25.1±0.54) mV，因为PAA/CuS-CaP NCs带有较多的负电，因此可以包载阳离子药物，将是阳离子药物较好的载体。

Table4 The particle size, polydispersity and zeta potential of PAA/CuS-CaP NCs 表4 PAA/CuS-CaP NCs的粒径及电位

2.2.8 透射电镜（TEM）分析

采用透射电镜对PAA/CuS-CaP NCs的形貌进行观察，结果见图5。从图5可知，PAA/CuS-CaP NCs结构完整，呈类球形，粒径大小为150 nm左右。

Fig.5 TEM image of PAA/CuS-CaP NCs 图5 PAA/CuS-CaP NCs的透射电镜图

2.3 PAA/CuS-CaP NCs光热转换性能的初步评价

利用溶液方法研究纳米材料的光热转换性能，在纳米溶液中放置温度传感器，测量在激光照射下溶液温度的变化，这种直接测试的方法比较简单和容易操作。取制备的PAA/CuS-CaP NCs水溶液1 mL，采用波长为808 nm近红外激光器（光强0.7 W·cm‒2），照射10 min，然后停止照射10 min，期间每30 s记录一次温度。为获得PAA/CuS-CaP NCs水溶液的光热转换效率，我们在相同的实验条件下，对空白溶剂去离子水进行光热性能的测试。光热转换特性见图6。

光热转换效率计算公式如下：

Fig.6 Temperature profiles of PAA/CuS-CaP NCs under the irradiation of the 0.7 W·cm-2 808 nm laser for 10 min 图6 PAA/CuS-CaP NCs溶液在808 nm近红外光照和避光条件下温度变化曲线

由图6可知，PAA/CuS-CaP NCs的溶液在808 nm激光的照射下，温度升高了20 ℃以上，按上述光热转换效率的计算公式（1）～（5）可以计算出PAA/CuS-CaP NCs的光热转换效率达到53%。因此制备的PAA/CuS-CaP NCs具有较好的光热转换特性，这也为纳米载体在肿瘤的热疗领域的应用提供实验基础。