嗜盐微生物对发酵海鲜调味品风味影响研究进展

于 靖 杨锡洪,2 梁 晨 郁东兴 解万翠,2,

(1. 青岛科技大学海洋科学与生物工程学院，山东 青岛 266042；2. 山东省生物化学工程重点实验室，山东 青岛 266042；3. 青岛智科检验检测有限公司，山东 青岛 266002；4. 尚好科技有限公司，山东 青岛 266002)

传统发酵型海鲜调味品如鱼露、虾酱等是由低值鱼虾蟹贝藻等经由盐渍、发酵等工艺加工制成[1]，味道鲜美，呈味成分丰富多样，富含多种呈味氨基酸如甘氨酸、谷氨酸、精氨酸和天门冬氨酸等，以及多肽、低聚糖和牛磺酸等多种保健性成分[2]，具有很大的发展前景及开发价值。但传统发酵过程中过高的盐度和自然温度导致发酵周期长、产量低、成本高、不利于规模化生产等弊端，因此，一些现代速酿技术如低盐保温工艺、外加酶法与外加曲法等成为近年来研究的重点方向。虽然速酿技术能显著缩短发酵进程，减少产物的含盐量和腥臭味，但快速发酵的产品风味难以与传统工艺媲美。因此，在缩短发酵周期的基础上尽可能模拟传统产品风味，是当前海鲜调味品速酿技术研究的热点问题。

传统发酵海鲜调味料的风味主要来源于微生物的发酵，通过微生物间的作用使最初的原料转化为发酵过程中的蛋白质、脂肪等物质，在一系列复杂化学反应中丰富产品风味。随着从各类海鲜调味品中分离出越来越多的微生物，研究者们发现海鲜调味品的速酿技术可以通过一些性能优良的嗜盐菌株进行改良。Saithong等[3]在自然发酵的鱼制品中分离到2种乳酸菌，能够显著缩短发酵周期，Yossan等[4]研究发现，在发酵鱼酱油中筛选出的巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)，能够产生碱性蛋白酶，促进风味物质前体氨基酸的转化，从而丰富产品醇香鲜美的口感。可见，嗜盐微生物分泌的蛋白酶、肽酶、碱性磷酸酶等不仅能够促进原料底物进行分解及生物转化，显著缩短发酵周期，还能将肽和寡肽转化为前体氨基酸从而形成海鲜调味品特有的风味物质，有利于海鲜调味品鲜美醇香气味的形成。文章拟介绍嗜盐微生物在海鲜调味快速发酵及风味形成中的应用，从氨基酸代谢和基因调控层面阐明嗜盐菌对速酿产品风味影响机理，以期为海鲜调味品现代化加工技术提供新的指导思路。

1 传统海鲜调味品的发酵风味特征

常见的海鲜调味品包括鱼酱、虾酱、蟹酱、鱼露、虾油、蚝油等，以海洋资源为原料，利用自身的酶或微生物通过一定的周期自然发酵而成。海鲜调味品发酵过程中，微生物能够利用其产生的胞内及胞外酶类加速原料底物的分解和生物转化，同时产生多肽、呈味氨基酸等多种利于良好风味形成的成分，以及各种挥发性和非挥发性风味物质共同组成的复杂化合物体系。

1.1 感官特征及特征性风味化合物

水产调味品品质的重要决定因素是其风味，明确风味物质的组成对调控与保持产品风味十分必要。在海鲜调味品发酵过程中，微生物与酶之间会在原料组分中相互作用，通过小分子物质的形成进而左右成品的风味，因此发酵工艺与产地不同而引起的挥发性物质组成差异使其形成了各自的风味特征。

醇类是海鲜调味品中主要挥发性物质之一，主要由多不饱和脂肪酸经脂肪酸氧化酶作用衍生而来[5]，是海鲜调味品植物香、肉香味和温和油脂味的主要来源[6]。赵洪雷等[7]在探究不同产地虾酱风味差异时发现，作为亚油酸降解产物的1-辛烯-3-醇，呈现草香味和蘑菇香气，苯乙醇呈蜂蜜香和微略的玫瑰香。由不饱和脂肪酸氧化产生的醛类物质，阈值较低，因此在发酵水产调味品风味特征中发挥重要作用[8]，主要产生油烧味，但其中苯甲醛和苯乙醛具有坚果香、水果香和令人愉悦的风信子香等独特香气[9]，3-甲硫基丙醛具有肉香和马铃薯香。酮类的香气阈值远高于其同分异构体的醛类物质，由于其具有独特的花香和果香味，对海鲜调味品风味有一定增强作用[10]。李莹等[11]在分析传统锦州白虾虾酱挥发性物质时发现，2-壬酮呈有焦糖香和脂肪味，3-辛酮呈有水果香和略微的薰衣草气味，香叶基丙酮呈现蜡味、木香味和果香味。含硫类化合物能够赋予产品坚果香、果蔬香、烘烤香和肉类香气，二甲基二硫与二甲基三硫主要具有洋葱香等蔬菜香气，是海鲜发酵调味料的特征风味物质。由脂肪氧化产物参与美拉德反应得到的吡嗪类物质，主要呈现坚果香和烘烤香味，Hou等[12]发现，吡嗪类既是酱类产品的特征性风味物质，也是鲜虾肉中主要的风味物质，可以赋予虾酱产品浓厚的酱香味和鲜味。

传统海鲜调味品开放式的自然发酵难以准确控制产品品质和风味，这是影响产品质量稳定的主要障碍，而现代发酵工艺得到的产品又往往存在风味不足的缺陷。因此，为实现产品质量和风味的稳定控制，海鲜调味品的速酿工艺还需要与微生物的发酵作用结合。

1.2 嗜盐微生物对海鲜调味品特征风味的影响

由传统海鲜调味品中分离的微生物，主要是一些嗜温及嗜盐的细菌，在发酵过程中对原料的分解和风味物质的形成发挥着关键作用。如表1所示，它们所产生的蛋白酶、肽酶和碱性磷酸酶等能够与原料自身所产酶类协同作用，加快原料底物分解，充分利用原料中的蛋白质、脂肪等物质，促进海鲜调味品中重要营养和风味物质的形成[22]。

表1 不同海鲜调味品中嗜盐微生物及其所产的酶

海鲜调味品中的嗜盐菌所分泌的胞内及胞外酶类不仅能够适应发酵过程中高温高盐特点，还能够与原料自身内源酶和微生物协同作用加快原料底物分解，大大缩短发酵周期[23]。Sinsuwan等[24]研究发现，存在于鱼酱油中的嗜盐枝芽孢杆菌(Virgibacillussp.) SK37，在高盐溶液中产生的胞外蛋白酶仍有水解活性。Akolkar等[25]探究了盐杆菌(Halobacteriumsp.) SP1在加速鱼酱油发酵进程中的作用，最终发现微生物菌群间之间产生了累加效应，含有盐杆菌的SP1(1)样品组在发酵中期，蛋白酶活性和α-氨基含量均较高，可见，盐杆菌SP1能够作为理想发酵剂缩短鱼酱油的发酵周期。

嗜盐微生物能够充分利用原料中的蛋白质、脂肪等物质，将其降解为形成风味前体物质的寡肽、低聚肽及脂肪酸等，促进海鲜调味品特征风味中低分子挥发性酸和呈味氨基酸等重要营养和风味物质的形成[26]，构成海鲜调味品独特的口感和风味。Beddows等[27]在研究细菌对发酵鱼酱油风味影响时发现，鱼酱油中的氨基酸经由细菌的代谢作用能够衍生形成多种呈味氨基酸如丙酸、丁酸等，使产品形成独特的奶酪香气。Udomsil等[28]发现嗜盐微生物分泌的内源酶活性对发酵型海鲜调味品的风味形成有重要作用，从鱼酱油中筛选到的嗜盐四联球菌MRC5-5-2和MS33，因其胞内氨基肽酶活性较高，可以产生促进产品肉味和杏仁味形成的苯甲醛和2-甲基丙醇。Udomsil等[29]在进行鱼酱油速酿发酵时，将筛选到的葡萄球菌(S.piscifermentans) CMC5-3-1作为功能性发酵剂，结果表明试验组中能够产生更多具有黑巧克力香气的2-甲基丙醛。

通过嗜盐微生物的代谢作用和生物转化还能够有效减少海鲜调味品发酵过程中不良风味的产生。向军等[30]发现，产氨基肽酶的甲基营养型芽孢杆菌(B.methylotrophicus)能够将苦味肽氨基端的疏水氨基酸切除，有利于减轻发酵产品中的苦味。段旭昌等[31]研究发现乳酸菌发酵可以使苦味氨基酸转化，改善甲鱼酶解液的整体风味，其中呈苦味的Asp、Cys、Val、Ile、Lys和Arg含量在发酵后期明显减少，而呈微苦味的Phe和甜味的Ala含量略微增加。Fukami等[32]研究发现，在鱼酱油发酵进程中添加木葡萄球菌能够减少产品中的鱼腥臭味和腐败酸味，显著提升产品风味品质。利用嗜盐微生物代谢作用提高海鲜调味品中特征风味物质的含量，有利于改良速酿工艺中产品风味不足的缺陷。

2 传统发酵海鲜调味品嗜盐菌代谢及风味形成机制

微生物代谢作为海鲜调味品挥发性风味物质形成的主要途径，是指导传统海鲜调味品速酿发酵技术并提升风味品质的突破点。其中不同种类的嗜盐微生物其代谢通路和基因特征不同，在海鲜调味品的原料分解和风味形成过程中均发挥积极贡献。

2.1 氨基酸代谢模式及途径

蛋白质分解释放出足够的氨基酸对海鲜调味品形成完整的风味是必不可少的，蛋氨酸和半胱氨酸等氨基酸是发酵食品中风味物质的主要来源[33]。研究[34]发现，亮氨酸是具有调节蛋白质代谢作用的主要支链氨基酸，由亮氨酸通过酮酸和醛转化为乙醇的途径为Ehrlich途径。支链醛类物质是发酵食品中的重要风味化合物，其中3-甲基丁醛和2-甲基丁醛是酱油中最重要的气味剂之一，具有麦芽样或巧克力样的强烈香气，主要由微生物的Ehrlich途径和支链氨基酸的生物合成途径产生[35]。如图1所示，3-甲基丁醛是亮氨酸分解代谢的中间体，亮氨酸与酮酸之间的氨基转移由亮氨酸氨基转移酶催化，通过对应的α-酮酸进一步被羟基异氰酸脱氢酶(PanE)降解为羟基酸，被α-酮酸脱羧酶(KivD)分解成醛、醇和酸等风味相关物质[36]。在支链氨基酸代谢途径中，α-酮酸是关键节点物质[37]，因此，提高氨基酸浓度和转氨酶活性能有效地增加α-酮酸含量，促进海鲜调味品发酵过程中特殊风味物质的形成。

图1 亮氨酸代谢产挥发性风味物质

由于多数细菌转氨酶活性较低，很难通过添加外源支链氨基酸来提高α-酮酸的生成量，进而抑制了挥发性风味物质含量的增加。而野生嗜盐菌株通常生活在氨基酸含量低的环境中，它们依赖于自身氨基酸的生物合成，因此具有更多的氨基酸转化酶，为食品原料中蛋白质的降解提供了良好途径。Udomsil[38]从发酵鱼酱油中筛选到7株乳酸菌，均具有较高的胞内氨基转化酶活性，促进了亮氨酸、精氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸、和谷氨酸等呈味底物的分解转化，进而丰富鱼酱油产品的特征风味。将嗜盐微生物用于海鲜调味品发酵进程，不仅能够增加各种呈味氨基酸的含量，还能提高由氨基酸衍生出的风味化合物水平。

2.2 基于基因组学的代谢调控

编码氨基酸转化酶的基因受到许多特定机制的调控，包括对酶及其合成的生物化学控制，以及在转录水平上运作的调节因子[39]。其中转氨酶基因(araT、bcaT、kivD、ytjE、panE)等的表达受全局调控因子CodY调控[40]。CodY在氨基酸降解、寡肽转运、胞外蛋白酶和支链氨基酸的生物合成等氮代谢方面具有重要的调控作用，能够通过改变转录速率调控靶基因的表达水平[41]。CodY基因的表达与胞内缬氨酸、异亮氨酸等支链氨基酸的水平有关，转氨酶基因表达水平在缬氨酸、异亮氨酸饥饿胁迫情况下能增强数倍。亮氨酸代谢产物3-甲基丁醛在异亮氨酸饥饿胁迫条件下的生成量比非饥饿培养条件增高了2倍。Yvon等[42]经研究发现亮氨酸、芳香族氨基酸和蛋氨酸转氨酶具有重叠的底物特性，将乳酸球菌属中的支链氨基转移酶敲除会导致亮氨酸转氨作用大大减少。此外，环境因素也能影响氨基酸代谢情况, 例如在酸胁迫条件下，作为乳酸菌代谢产物的支链醛含量有所增加。

嗜盐菌不仅能通过改变碳、氮代谢来应对高酸、高盐等胁迫环境，还可以通过CodY调控自然感受相关基因，使菌体对外源DNA的摄入量得以提高，从而获取有助于应对胁迫环境的基因，增强菌株的生长能力。通过研究CodY调控对细菌的碳、氮代谢和自然感受态相关基因的影响，能够获得基因优化改良的嗜盐菌株，用于海鲜调味品的发酵生产工业。

Satomi等[43]在研究鱼酱油风味时发现，嗜盐四联球菌(Tetragenococcushalophilus)的质粒上含有hdcA基因，可以通过编码组氨酸脱羧酶将组氨酸转化为组胺，进而调节产品风味。Higuchi等[44]发现含有天冬氨酸脱羧酶的嗜盐菌可通过其质粒上的aspD编码的脱羧作用，将天冬氨酸转化为丙氨酸，使酸性氨基酸的含量减少，甜味氨基酸的含量增加，从而使口感变得温和。Wakinaka等[45]用含溴甲酚紫的天冬氨酸指示剂从发酵鱼类食品中分离出嗜盐四球菌(Tetragenococcushalophilus)，并证实其携带天冬氨酸脱羧酶基因(aspD)，将此菌株作为鱼露发酵剂可以实现天冬氨酸向丙氨酸的转化，从而得到口感更加柔和的鱼露产品，同时阻止了生物胺在鱼露产品中的积累。因此，通过选定或敲除嗜盐微生物上的特定基因，可以调控氨基酸代谢产物，在减少生物胺积累的前提下提升海鲜调味品风味品质，为在发酵食品工业中利用基因工程改造技术获得适当菌株奠定了基础。

3 嗜盐微生物对生物胺等的影响

生物胺是存在于鱼酱油、虾酱等发酵产品中的碱性含氮化合物，能与亚硝酸盐反应生成亚硝胺等致癌物质[46]，过多的摄入可能导致人体中毒。部分嗜盐菌含有内源氨基氧化酶，能够通过氧化脱氨基作用将生物胺降解同时产生醛类和氨类等风味物质，从而降低海鲜调味产品中生物胺的含量，提升产品的营养和保健功效。

姜维[47]从传统发酵的鱼酱油中分离到了汕头盐单胞菌(Halomonasshantousisnov.)，研究发现此菌株能在自身不积累生物胺的前提下将生物胺高效降解，将其作为功能发酵剂用于鱼酱油的发酵，能显著降低产品中腐胺、组胺、尸胺和酪胺含量。Zaman等[48]从鱼酱油中分离到了解淀粉芽孢杆菌FS05和肉葡萄球菌FS19，发现这两种菌株均具有氨基氧化酶活性，能够显著降低鱼酱油发酵后期的组胺含量。

海鲜调味品中的嗜盐菌作为功能性发酵剂能够显著减少发酵过程中生物胺的积累，提高产品品质功效，有利于适应和促进中国食品工业的发展。

4 结束语

微生物发酵法的应用是海鲜调味品健康生产的重要发展趋势，应用嗜盐微生物中氨基酸转化酶调节原料底物的分解代谢，以及利用基因改造的嗜盐菌株调控代谢产物，能够在显著缩短发酵周期的同时有效模拟发酵产品的传统风味。继续探究嗜盐菌的具体代谢机制以及外源氨基酸对产品品质及特征风味影响从而改进生产工艺，有望在保持海鲜调味品传统风味的基础上，实现加工生产效率和产品品质的不断提升。