野地瓜茎正丁醇萃取物中主要抗氧化活性成分的筛选

刘永玲 叶思帆 杨 怡 方丽红 赵治兵 谢国芳

(1. 贵阳学院食品与制药工程学院，贵州 贵阳 550005；2. 贵州省果品加工工程技术研究中心，贵州 贵阳 550005；3. 湖南大学，湖南 长沙 410082)

野地瓜又名地果、地枇杷、过山龙、地板藤等，隶属桑科榕属多年生匍匐木质藤本。野地瓜为食药两用资源，广泛分布于中国的四川、贵州、广西、湖南等地，多野生，其果实营养丰富，全株均可入药，外用可治无名肿毒、烫火伤、止血等，煎药内服可治风热咳嗽、痢疾、水肿、黄疽、风湿疼等病症[1]。现代研究[2-3]发现，该属植物具有降血糖、抗肿瘤、抗菌、抗炎等作用。野地瓜含有多种化学成分，包括三萜类、甾醇类、香豆素类、酚苷类、脂肪酸类、烷烃类、多糖类和黄酮类物质[4-5]。虽然已有野地瓜地下根中部分萃取物的抗氧化性报道[6-7]，但未见对野地瓜地上匍匐茎中抗氧化活性及抗氧化活性成分筛选和鉴定的研究报道。

开发具有抗氧化活性的天然产物成为目前食品和药物领域的研究热点，为此寻找各种高效分离和筛选天然产物的方法成为了人们研究的焦点。其中高效液相色谱串联自由基清除活性化合物检测系统(HPLC-DAD-DPPH)在线检测抗氧化活性化合物的方法发展较快[8-9]，即高效液相色谱(HPLC)柱后在线添加稳定的DPPH自由基，提取物经高效液相色谱柱分离后经反应环，洗脱液中的抗氧化剂与DPPH自由基发生给质子作用使其在517 nm处的特征吸收峰消失，在色谱图中形成负吸收峰，实现了粗提物中抗氧化成分的在线筛选和检测，但对具有抗氧化活性的成分不能快速鉴别。近年来，出现了在线高效液相色谱—质谱—二苯基三硝基苯肼(HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH)技术，即在高效液相色谱串联自由基清除活性化合物检测系统筛选抗氧化成分的基础上，结合质谱在线分析，使天然活性产物一次进样便能从复杂混合物中在线筛选并鉴别具有清除DPPH自由基作用的化合物，弥补了采用单一技术缺乏抗氧化活性成分快速鉴定能力的不足[10-11]。

为探讨野地瓜茎中抗氧化活性成分，试验拟采用DPPH、ABTS、TRPA 3种体外抗氧化试验筛选野地瓜茎不同极性萃取提取物，结合HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH技术快速筛选并鉴定有抗氧化活性的成分，以期为野地瓜中抗氧化物质的研究开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

野地瓜茎样品：于2019年2月中旬采自贵州省毕节市赫章县白果镇犀牛唐村高桥组，经贵阳学院杨碧仙教授鉴定为桑科榕属野地瓜(FicustikouaBur.)的茎；

C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)：WondaSil，日本岛津公司；

PEEK盘管(15 m×0.254 mm)：日本岛津公司；

三吡啶三吖嗪(TPTZ)、2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)：美国Sigma公司；

1,1-二苯基-2-苦基肼基(DPPH)：南京奥多福尼生物科技有限公司；

抗坏血酸、三氯乙酸(TCA)：分析纯，上海聚源生物科技有限公司；

绿原酸：纯度>97%，中国食品药品检定研究院；

新绿原酸、隐绿原酸：纯度≥98%，美国斯坦福分析化学品公司；

甲醇：色谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；

试验用水为超纯水：北京嘉远环保科技有限公司；

其他试剂为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计：UV-2550型，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：LC-20A型，配二极管阵列(DAD)检测器，日本岛津公司；

高效液相色谱仪：LC-16型，配UV检测器，日本岛津公司；

质谱仪：X500R QTOF型，美国AB SCIEX公司；

研磨机：A11型，德国IKA公司。

1.3 测定指标与方法

1.3.1 野地瓜茎浸膏及不同萃取物的制备 取干燥的野地瓜茎(用蒸馏水洗净泥土，阴干)粉碎，称取200 g，按液料比20∶1 (mL/g)投料，于80 ℃下用75%乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液后减压浓缩至无醇味得浸膏50 g，加入100 mL蒸馏水使浸膏充分溶解成混悬液，置于分液漏斗中，依次以两倍体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇分级萃取，直至颜色变浅，得到相应萃取组分和上层被萃取水相，将各萃取液用旋转蒸发仪减压浓缩后于75 ℃烘箱下烘干，分别得到石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇、水相提取物为1.95，3.20，4.06，12.04，18.90 g，即得率分别为0.98%，1.60%，2.03%，6.02%，9.45%，置于4 ℃冰箱内备用。

1.3.2 野地瓜茎不同极性萃取物抗氧化活性测定 分别精密称定1.3.1条件下的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇和水相萃取物，以VC为阳性对照进行抗氧化活性分析。

(1) DPPH自由基清除率：根据文献[12]。

(2) ABTS自由基清除率：根据文献[13]。

(3) 总还原力(TRPA)：根据文献[14]。

1.3.3 溶液的配置

(1) DPPH自由基溶液的配制：称取DPPH标准品，精密称定，配制成浓度为25 μg/mL的甲醇溶液，0.45 μm滤膜过滤，现配现用。

(2) 样品溶液的制备：精密称定1.3.1条件下野地瓜茎正丁醇萃取物2.0 mg，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.3.4 色谱与质谱工作条件 HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH在线筛选野地瓜茎正丁醇萃取物中抗氧化活性成分参数及装置流程参照耿丹丹等[15]的方法并稍作改动。

(1) HPLC-1(LC-20A高效液相色谱仪)工作条件：色谱柱为WondaSil C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为甲醇(A)—0.2%冰乙酸溶液(B)，梯度洗脱程序为0～8 min，20%～25% A；8～13 min，25% A；13～35 min，25%～60% A；35～37 min，60%～20% A；37～43 min，20% A；流速1.0 mL/min；DAD检测器，检测波长300 nm；进样量10 μL；柱温25 ℃。样品经HPLC-1色谱柱后分流至HPLC-2的流速0.7 mL/min，HPLC-1色谱柱后分流至质谱的流速0.3 mL/min。

(2) HPLC-2(LC-16高效液相色谱仪)工作条件：反应环为PEEK盘管(15 m×0.254 mm)；流动相为DPPH甲醇溶液(25 μg/mL)，流速0.45 mL/min，UV检测器，检测波长517 nm。

(3) 质谱工作条件：AB SCIEX X500R QTOF质谱仪；电喷雾ESI，正离子模式；离子源温度550 ℃；离子源电压5 500 V；MS扫描范围50～1 500 Da；MS/MS扫描范围50～1 500 Da；MS诱导碰撞电压10 V；MS/MS诱导碰撞电压35 V。

1.4 数据处理

野地瓜茎不同极性组分体外抗氧化活性测定，每个处理进行3次重复试验。试验数据用Excel进行整理，测定结果用平均值±标准误差来表示。自由基清除率试验的半数抑制浓度IC50值用SPSS 22.0的Probit Regression计算；试验数据采用IBM SPSS 22.0软件进行单因素差异分析，以P<0.05为具有统计学显著差异；GraphPad Prism 7.0、中药色谱指纹图谱相似度评价系统作图。

2 结果与分析

2.1 野地瓜茎不同极性萃取物抗氧化活性评价

2.1.1 DPPH自由基和ABTS自由基清除作用 野地瓜茎不同极性萃取物与VC经试验选择合适的浓度后对DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力分别见图1、2。由图1、2可知，各极性萃取物均表现出一定的DPPH自由基和ABTS自由基清除活性，且随着浓度的增加，清除能力逐渐增强，表现出剂量相关性。其中正丁醇、乙酸乙酯萃取物和VC在低浓度下就显示出较好的DPPH自由基和ABTS自由基清除效果。图1中，VC和正丁醇、二氯甲烷、水相萃取物的浓度分别为16，20，100，200 μg/mL时清除DPPH自由基的能力差异不显著，说明VC具有较强清除DPPH自由基的能力；根据表1得知正丁醇和乙酸乙酯萃取物对DPPH自由基的IC50值分别为(23.28±0.21)，(38.50±0.38) μg/mL，且VC和正丁醇萃取物对DPPH自由基的IC50差异不显著，由此得到野地瓜茎不同极性萃取物清除DPPH自由基能力的顺序为VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。图2中，浓度为100 μg/mL时，各极性萃取物对ABTS自由基的清除率具有显著性差异(P<0.05)，即正丁醇萃取物对ABTS自由基的清除率分别是VC、乙酸乙酯、二氯甲烷、水和石油醚萃取物的0.78，1.22，3.54，8.52，16.90倍，且根据表1中各极性萃取物的IC50值，得到野地瓜茎不同极性萃取物清除ABTS自由基能力的顺序为VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。这一结果与杨世波等[6]报道的野地瓜根中的抗氧化活性成分主要集中在其乙酸乙酯和正丁醇萃取物中的结论相似。

字母不同表示数据间存在显著性差异(P<0.05)

字母不同表示数据间存在显著性差异(P<0.05)

2.1.2 总还原力 抗氧化剂的还原能力与抗氧化活性呈正相关。按照TRPA的测定方法，抗氧化剂的抗氧化活性越高其在700 nm处的吸光度值越高[16]。在测定的质量浓度范围内(图3)，野地瓜茎不同极性萃取物与VC均有一定的还原能力，且随质量浓度的增加而增加，其中正丁醇、乙酸乙酯、二氯甲烷萃取物和VC在低浓度下就显示出较好的还原能力，且在相同质量浓度为50 μg/mL时各极性萃取物具有显著性差异(P<0.05)，正丁醇萃取物的还原能力分别是VC、乙酸乙酯、二氯甲烷、水和石油醚萃取物的0.7，1.4，2.1，4.1，6.6倍，由此得出各极性萃取物的还原能力大小顺序为VC>正丁醇>乙酸乙酯>二氯甲烷>水>石油醚。这一结果与DPPH自由基、ABTS自由基清除能力表现出一致的抗氧化效果，不同方法活性稍有不同。

表1 野地瓜茎不同极性萃取物和阳性对照VC对ABTS自由基和DPPH自由基的IC50†

字母不同表示数据间存在显著性差异(P<0.05)

试验以VC为对照，采用DPPH、ABTS和TRPA 3种化学方法，综合分析野地瓜茎5种不同极性萃取物的抗氧化活性，筛选出正丁醇萃取物相对于其他极性萃取物具有显著的抗氧化活性(P<0.05)，3种方法对野地瓜茎不同极性萃取物的抗氧化活性测定是可互换的，故对筛选出的正丁醇萃取物进行抗氧化活性成分的筛选和鉴定。

S1. HPLC-1，DAD检测器300 nm S2. HPLC-2，UV检测器517 nm

2.2 野地瓜茎正丁醇萃取物抗氧化成分的在线筛选

分析所测化合物是否具有抗氧化活性是以与DPPH自由基溶液反应，在517 nm下的特征峰消失而形成负峰色谱图为依据的[17]。试验对HPLC-1分析的检测波长进行选择，考察了正丁醇萃取物在常用的230，254，280，300，360 nm下的吸收情况。结果发现，正丁醇萃取物在各个波长下的色谱峰基本一致，但具有抗氧化活性化合物形成的负峰在300 nm处吸收更强。因此，选择HPLC-1的检测波长为300 nm。如图4所示，S2中的1、2、3号峰为正丁醇部位信号最强的抗氧化活性成分。

2.3 野地瓜茎正丁醇萃取物抗氧化成分的ESI-MS鉴别

由图5可知，化合物1～3的准分子离子峰[M+H]+m/z分别为355.102 1，355.102 2，355.101 8，在MS/MS中分别出现了m/z163.038 5，163.038 3，163.038 6的咖啡酰基等特征碎片离子峰，推断其分子式为C16H18O9，由于具有相同的碎片离子，推测化合物1～3为绿原酸的同分异构体[18]。依据文献[19—20]报道，单咖啡酰奎尼酸和二咖啡酰奎尼酸所组成的绿原酸异构体共有10种，其中单咖啡酰基奎尼酸有4种，分别为1-O-咖啡酰奎尼酸、3-O-咖啡酰奎尼酸、4-O-咖啡酰奎尼酸和5-O-咖啡酰奎尼酸，但到目前为止，仅有3-O-咖啡酰奎尼酸、4-O-咖啡酰奎尼酸和5-O-咖啡酰奎尼酸在植物中发现。赵玉荣等[21]、Nobuji等[22]报道植物中多同时存在3-O-咖啡酰奎宁酸的异构体，其中包含3-O-咖啡酰奎宁酸、4-O-咖啡酰奎宁酸及5-O-咖啡酰奎宁酸；3-O-咖啡酰奎宁酸异构体在C18柱的洗脱顺序为5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸和4-O-咖啡酰奎宁酸。根据文献[18，21-25]和3种单咖啡酰奎宁酸的出峰时间鉴定化合物1～3分别为5-O-咖啡酰奎宁酸(新绿原酸)、3-O-咖啡酰奎宁酸(绿原酸)和4-O-咖啡酰奎宁酸(隐绿原酸)。为了进一步验证试验的推测，通过在液相与对照品比对保留时间进一步得到确认。

图5 5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸和4-O-咖啡酰奎宁酸的HPLC/ESI-MS正离子模式质谱图

综上，根据[M+H]+的相对分子质量以及二级谱图，结合DAD光谱图、对照品及相关参考文献[23-25]，鉴定化合物1～3为5-O-咖啡酰奎尼酸、3-O-咖啡酰奎尼酸和4-O-咖啡酰奎尼酸。野地瓜茎正丁醇萃取物抗氧化活性成分的鉴定结果见表2。

表2 野地瓜茎正丁醇萃取物中抗氧化活性成分分析

3 结论

(1) 采用乙醇回流法提取了野地瓜茎中的活性成分，以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇从野地瓜茎水相混悬液萃取得到不同极性萃取物，综合3种体外抗氧化试验(DPPH、ABTS和TRPA)的结果得到野地瓜茎正丁醇萃取物具有显著的抗氧化活性(P<0.05)。

(2) 采用体外抗氧化性试验所筛选到的正丁醇部分经在线HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH技术筛选并鉴定出5-O-咖啡酰奎宁酸、3-O-咖啡酰奎宁酸和4-O-咖啡酰奎宁酸3种化合物，具有显著抗氧化能力。由于这类化合物的结构中存在酯键、不饱和双键和多元酚，在提取过程中，往往会通过水解和分子内酯基迁移而发生异构化，如3-O-咖啡酰奎宁酸酯键断裂产生奎尼酸峰(m/z191)和咖啡酰基峰(m/z163)，咖啡酰基在奎尼酸上的不同取代形成了不同的衍生物，因此课题组后期对这3种活性抗氧化化合物进行分离时应注意提取工艺的优化。

(3) 在线高效液相色谱—质谱—二苯基三硝基苯肼(HPLC-DAD-ESI/MSn-DPPH)技术的出现对天然抗氧化活性成分的快速筛选和解析提供了新的途径，与体外抗氧化试验表现出互补优势。后期研究中，将对野地瓜茎正丁醇部分3种抗氧化活性化合物进行进一步分离、纯化以及鉴定。