酪蛋白磷酸肽钙磷复合物促进早期牙酸蚀症再矿化的体外研究

王伟萍，何庆银，张恒俊

（佛山科学技术学院附属口腔医院·佛山市口腔医院，广东佛山528000）

牙酸蚀症是在没有细菌参与的情况下，由接触牙面的酸或其螯合物的化学侵蚀作用而引起的一种慢性病理性的牙体硬组织丧失［1］。自20世纪80年代以来，伴随着我国人民生活水平的提高及酸性饮料的消费量增加，牙酸蚀症的患病率明显上升。酸性饮料引起的牙酸蚀症已引起人们的关注，正成为一个新的影响青少年口腔健康的问题［2-3］。对早期牙酸蚀症进行再矿化治疗，能防止其病损进一步发展，促进脱矿釉质恢复到正常状态。

本研究通过体外模拟牙酸蚀症，研究酪蛋白磷酸肽钙磷复合物（CPP-ACP）对早期牙酸蚀症的再矿化作用，为临床更好地治疗牙酸蚀症提供依据。

1 材料和方法

1.1 牙体标本的制备

选取本院因正畸减数所拔除的新鲜前磨牙，体视显微镜放大10倍下检查，无龋坏、裂痕、缺损和釉质白斑者纳入实验。流水下截冠去髓后，用自凝型义齿基托树脂包埋釉质块基底，测试面釉质严格磨平抛光，暴露正中3 mm×3 mm开窗区，其余区域用指甲油封闭。

1.2 体外模拟酸蚀症

将60个制备好的标本浸泡在可口可乐中。饮料浸泡是间断性的，每次浸泡1 min，取出30 s，再浸入，反复多次，历时10 min，然后用蒸馏水清洗5遍，置于37℃人工唾液恒温箱。每天重复上述的操作10次，12 h内完成。共处理7天。

1.3 CPP-ACP的配制

称取1 g CPP溶解于50 mL浓度为72 mmol/L磷酸钠缓冲液（pH值7.0），置于电磁力搅拌器上搅拌，逐滴加入1.0 mol/L的CaCl2溶液，用KOH维持pH值不变，再加入6 mL CaCl2后，用去离子水调整溶液的体积至100 mL，最后配制成pH值为7.0的1%CPP-ACP溶液（含1.0%W/V的CPP，60 mmol/L CaCl2，36 mmol/L 磷酸钠）［4］。

1.4 分组和再矿化实验

根据体外酸蚀后的牙釉质表面硬度将60个样本随机分成4组，每组15个，分别浸泡在4种再矿化液中：0.2%NaF溶液（A组）、1%CPP-ACP溶液（B组）、0.2%NaF+1%CPP-ACP溶液（C组）和去离子水（D组）。置于37℃恒温箱内，浸泡液每天更换一次，7 d后结束实验。

1.5 牙釉质表面硬度测量

各组样本分别在基线、可乐酸蚀后和再矿化后用维氏显微硬度计测定釉质表面硬度（SMH）。采用DHV-1000型显微硬度计，物镜放大40倍，将标本固定在载物台上，使用维式压头，负荷100 g，时间15 s，使其形成压痕，显微镜下测量菱形压痕的两条对角线长度，经分析系统自动计算出硬度值。每一个开窗面测定5个点，去掉最大值和最小值后取平均值作为该开窗釉质表面的硬度值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 肉眼观察

人工牙酸蚀后，所有开窗区的牙釉质表面完好，无缺损，无光泽，呈白垩色，吹干后白垩色更明显。经4种再矿化液处理后，开窗区牙釉质仍呈白垩色，除去离子水组外，其余3组白垩色较再矿化前浅。

2.2 釉质表面显微硬度测量

在实验前和体外牙酸蚀后，各组之间的釉质表面显微硬度相比较，差异无统计学意义（p＞0.05），具有可比性。经过4种不同溶液处理后，其他3组的釉质表面显微硬度较去离子水组均显著增加，差别有统计学意义（p＜0.05），且C组增加最多，除了A、B组的釉质表面显微硬度无明显差异（F=2.961，p=0.096）外，其余两两比较，差异均有统计学意义（p＜0.001）。结果如表1所示。

表1 各组标本开窗区表面硬度值HV（±s，n=15） （Pa）

表1 各组标本开窗区表面硬度值HV（±s，n=15） （Pa）

组别A 组（0.2%NaF）B组（1%CPP-ACP）C 组（0.2%NaF+1%CPP-ACP）D组（去离子水）F值p值基线302.03±8.61 301.85±9.91 304.05±7.68 304.55±7.64 0.392 0.759体外牙酸蚀后61.14±3.25 61.23±3.50 60.95±2.76 61.18±3.57 0.02 0.996再矿化后114.97±6.79 118.99±5.98 176.28±6.61 61.37±5.62 841.92＜0.001

3 讨论

牙酸蚀症于1907年首次被报道，患病率从20%～71%不等，且呈上升趋势，近年来明显增高［5］。牙酸蚀症的致病因素是复杂的，酸性饮料起重要作用［6］。有学者对牙酸蚀症进行临床调查，发现摄入酸性饮料多的人群患有牙酸蚀症明显高于酸性饮料摄入量少的人群［7］，多个体外研究也表明酸性饮料可以导致牙釉质及牙本质脱矿，继而造成牙酸蚀症［8-9］。牙酸蚀症早期牙釉质光滑面轻微脱矿出现白垩色，但通过肉眼很难准确判断。釉质表面硬度是牙釉质重要的物理性能之一，Featherstone等［10］证实釉质显微硬度值的大小与其矿物含量具有直线相关性。故本实验选择市面上常见的可乐碳酸饮料给予长时间、多频次的持续干预，模拟正常口腔内饮用酸性饮料的状态，制备出牙酸蚀症模型，然后通过测量其釉质表面显微硬度的变化来反应釉质矿物质的丧失和获得。7 d后所有样本的釉质表面硬度较酸蚀前明显降低（p＜0.05），差别具有统计学意义。这与刘志萍［11］等人研究饮料对牙釉质硬度影响得出的结果一致。由此可见，可乐碳酸饮料可以促使牙釉质酸蚀脱矿。

早期牙酸蚀症主要表现为釉质脱矿。如果能对脱矿的牙釉质进行再矿化治疗，使流失的钙、磷等无机离子重新在已脱矿的牙釉质表面沉积并结晶化，就可以阻断牙酸蚀症的进一步发展。氟化物是最经典的再矿化材料。当牙受酸侵蚀时，口腔环境中pH值下降，釉质的羟磷灰石（HA）溶解，氟可与釉质中羟基离子交换形成氟磷灰石（FA）重新沉积于脱矿的釉质表面，或吸附于HA上直接进入晶体形成氟羟磷灰石（FHA），促进再矿化。有学者研究指出，低浓度氟化物的再矿化效果并不明显，当氟的浓度增加到1 000～1 500 mg/L以上时，其作用会发挥得更好［12］。但是高浓度氟化物的使用存在很大的安全问题，长期应用可能会导致慢性氟中毒如氟牙症和氟骨症，还会诱使耐氟菌株的产生［13］等。因此探索新的安全有效的再矿化材料势在必行。酪蛋白磷酸肽（CPP）是从牛奶中酶解消化后分离纯化而提取的生物活性多肽，具有食用安全、致敏性小、无细胞毒性的优点［14］。CPP有很强的促钙吸收活性，可与非结晶型磷酸钙（ACP）结合形成纳米晶簇酪蛋白磷酸肽钙磷复合物（CPP-ACP）。CPP-ACP在牙釉质表面始终保持一种过饱和的状态，为牙齿提供具有生物活性的钙、磷离子的储库，起到抑制牙釉质脱矿并促进再矿化的作用［15］。

本实验以0.2%NaF为阳性对照组，以去离子水为阴性对照组，采用测量釉质表面显微硬度来研究CPP-ACP对酸蚀釉质的作用。结果显示：1%CPP-ACP和0.2%NaF均能使可乐酸蚀后的牙釉质表面显微硬度显著增加，两组的釉质表面显微硬度比较差别无统计学意义（p＜0.05），这表明1%CPP-ACP有促进酸蚀脱矿的牙釉质再矿化作用，该作用与0.2%NaF相当，这与其他学者的研究结果［16-17］相似。使用1%CPP-ACP+0.2%NaF的混合液再矿化后与单独使用CPP-ACP或NaF相比，前者的釉质表面显微硬度明显高于后者，差别有统计学意义（p＜0.05），提示氟的加入增强了CPP-ACP的再矿化能力。这种协同作用可能与CPP稳定钙磷离子的同时可以结合氟离子，形成一种新型的非结晶型磷酸氟钙相（ACFP）有关［18］。ACFP中的氟离子活性增强，更具有渗透力，能够进入龋损深层，促进再矿化时晶体的生长，加上CPP结合的ACP在牙釉质表面始终保持钙磷饱和的状态，因此ACFP对脱矿牙釉质的再矿化作用相当明显。国内外多位学者的研究证实该观点［19-20］。

综上所述，CPP-ACP是一种天然的再矿化制剂，相比于氟化物，无毒副作用，安全性能高，可与氟协同再矿化作用，这为早期牙酸蚀症的防治提供一种新思路，但其确切作用机制及有效实际应用仍待进一步研究。