金枪鱼骨胶原多肽螯合钙的制备

周小敏，郑万源，李澄

浙江兴业集团有限公司（舟山 316000）

金枪鱼为鲈形目（Pereiformes）鲭科（Scombridae），属大洋洄游鱼类[1]，是世界重要远洋捕捞对象，据联合国粮农组织统计[2]，金枪鱼年捕获量超6×106t[3]。我国金枪鱼捕捞量也逐年上升，已形成较为完整的加工产业链。

金枪鱼加工过程会产生超总质量10%的鱼骨，这类资源通常被丢弃，既浪费宝贵资源，又污染环境。鱼骨富含钙和胶原蛋白[4]，且同陆生动物相比，这类胶原蛋白生物活性更强、抗原性更弱，赋予其良好的生物相容性，可广泛用于美容、烧伤烫伤等医疗领域[5-8]。

缺钙是人类共同的营养疾病，在亚洲地区尤为突出[9-10]。当前国内外钙补充剂包括无机钙和有机钙。这两种钙源普遍存在吸收率低、易引发受体机体紊乱等问题[11-13]。而随着营养学的进步，关于钙的吸收出现了新的理论[14]，诸多研究发现动物体内存在独特的生物肽转运体系，能够完整吸收金属和肽的螯合物。在这一理论指导下，诸多学者通过螯合技术制备了钙螯合肽，在给机体补充蛋白的同时，也实现了矿物元素的高效吸收[15]，给这类副产物的高值化利用提供了借鉴。

研究通过将下脚料鱼骨经酶解脱肉后碱法去脂，干燥成粉；经酶解后其酶解液与氯化钙进行螯合制备螯合钙，通过正交试验等手段确定金枪鱼骨的最佳酶解工艺和螯合工艺，为金枪鱼骨这类副产物的高值化利用提供借鉴，同时有望开发一款新型的钙补充剂。

1材料与方法

1.1 材料与试剂

金枪鱼骨由浙江兴业集团有限公司提供；Gly-Gly-Tyr-Arg（Sigma公司）；氢氧化钠等均为分析纯，均购于国药集团上海公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（安捷伦）；ELX808酶标仪（美国伯腾）；Nicolet6700傅里叶红外光谱（美国Thermo Nicolet公司）；原子吸收光谱仪（日本岛津）；高分辨场发射透射电子显微镜（Tecnai G2 F20S-TWIN，美国FEI）；纳米粒度表面电位分析仪（Nano-ZS90，Malvern英国马尔文仪器有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 金枪鱼骨粉的制备工艺

将500 g金枪鱼骨下脚料掰开成3～4节的小段，加入10倍体积水，随后加入1‰胰蛋白酶+1‰风味蛋白酶于55 ℃水浴锅中酶解2 h（搅拌器500 r/min），

灭酶活后用清水将鱼骨冲洗干净，加入鱼骨量5%的NaOH，于40 ℃水浴中浸泡2 h，清水洗净后烘干打粉即制得鱼骨粉（过40目筛）。

1.3.2 金枪鱼骨胶原多肽制备工艺（参见图1）

图1 金枪鱼骨胶原多肽制备工艺图

1.3.3 胶原多肽浓度的测定[16]

精确量取2.5 mL样品，加入2.5 mL 10 g/100 mL的三氯乙酸（TCA）后振荡混合，静置10 min，离心15 min（4 000 r/min），取上清液至50 mL容量瓶中，以5% TCA定容；量取6.0 mL该溶液于试管中，加入4.0 mL配制好的双缩脲溶液，混合振荡后静置10 min，2 000 r/min离心10 min，取上清液并测定上清液OD值（540 nm），对照标准曲线确定多肽含量。同时制作标准曲线。

1.3.4 螯合试验流程（参见图2）

图2 螯合试验流程图

式中：mb和ma分别表示反应前后体系中钙的质量，mg。

1.3.5 胶原多肽分子量的测定[17]

色谱条件：色谱柱TsK gel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流动相为乙腈-水-三氟乙酸（30∶70∶0.1，体积比）。

样品制备：以乙腈为溶剂配制浓度为5.00 mg/mL的样品，样品进样前用孔径为0.45 μm的微孔滤膜过滤。

标准品准备：标准品为牛血清蛋白（Mr66430）、RNase A（Mr13700）、抑肽酶（Mr6500）、维生素B12（Mr1355）、庆大霉素（Mr576），将标准品配制成混合标准溶液，每种物质含量均为5.00 mg/mL。

1.3.6 傅里叶红外光谱（FT-IR）分析

红外光谱分析的扫描波长范围为4 000～500 cm-1，所得数据利用Origin 7.0软件进行处理。

1.3.7 螯合肽投射电镜表征分析

样品先进行真空冷冻干燥，而后取适量样品溶解于乙醇中并超声处理10 min，后用滴管取适量样品上样于铜网，待乙醇挥发后，用透射电镜对螯合肽进行观测并拍照。

1.3.8 螯合肽粒度分析

用纯水为溶剂，溶解适量样品后，利用表面电位分析仪测定悬浮样品粒度。

2 结果与讨论

2.1 金枪鱼骨胶原多肽制备最佳酶解条件的确定

金枪鱼骨粉酶解单因素试验的基本条件为料液比1∶3（g/mL）、起始pH 7.0、酶解温度55 ℃、试验用酶添加比例1∶1、酶解时长4 h。各试验因素水平分别为：pH 6.0，6.5，7.0，7.5和8.0；温度45，50，55，60和65 ℃；酶制剂的复合比（某蛋白酶与风味蛋白酶质量比）1∶3，1∶2，1∶1，2∶1和3∶1。每个水平重复2次，结果取平均值。

2.1.1 水解酶类的确定

表1是不同酶制剂对骨粉的水解结果。从表1中可知，胰蛋白酶+风味蛋白酶复合水解所得的胶原多肽浓度最高且分子量小于4 000 Da胶原多肽占比最大，故综合选择第1组即胰蛋白酶+风味蛋白酶（FM）复合水解金枪鱼骨粉制备骨胶原多肽。

2.1.2 水解起始pH的确定

选用胰蛋白酶与风味蛋白酶质量比1∶1进行酶解，继续后续试验，改变起始pH，测定胶原多肽浓度。

如表2所示，胶原多肽的浓度同pH呈正相关关系，当pH为7.0～7.5时，胶原多肽浓度最高，而后胶原多肽浓度随pH增大反而降低。这是由于在较高和较低的pH下，生物活性酶的分子构象发生变化，其催化活性降低[18]；在生物酶的最佳pH条件下，酶的化学反应速度达到顶峰，反之，pH距离其最佳pH越远，催化活性越低。因此选择pH为7进行后续的试验。

表2 酶解pH对多肽浓度的影响

2.1.3 胰蛋白酶与风味蛋白酶复合比的确定

将胰蛋白酶与风味蛋白酶进行表3所示的比例进行复合酶解，测定胶原多肽浓度。如表3所示，胰蛋白酶与风味蛋白酶复配比2∶1时，多肽浓度最高，随着风味蛋白酶比例增多，多肽浓度降低，因此选择复配比2∶1进行后续试验。

表3 生物酶比例对多肽浓度的影响

2.1.4 酶解温度的确定

不同酶解温度得到的胶原多肽浓度也不同，分别在表4所示温度下进行酶解，测定胶原多肽浓度。

如表4所示，随着温度的升高，胶原多肽浓度随之升高，60 ℃时多肽浓度最高，这是因为温度也是影响酶活性的重要因素，温度过高同样会影响酶的空间构象，进而影响酶的生物催化能力，严重时会造成酶的失活。因此选择60 ℃进行后续的试验。

综上所述，金枪鱼骨粉酶解的最适条件为：料液比1∶3（g/mL）、起始pH 7.0、酶解温度60 ℃、2种酶复配比2∶1、酶解时间4 h。

2.2 最佳螯合条件的确定

骨胶原多肽与氯化钙螯合的单因素试验的基本条件为：温度50 ℃、螯合时间40 min、pH 6.0、胶原蛋白与氯化钙质量比1∶1。改变其中1个条件，固定其他条件以分析各单因素对螯合率的影响。各因素水平为：温度40，45，50，55和60 ℃；螯合时间30，40，50和60 min；pH 5.0，5.5，6.0，6.5和7.0；质量比3∶1，2∶1，1∶1，1∶2和1∶3。每个水平重复2次，结果取平均值。

2.2.1 螯合温度对螯合率的影响

螯合率结果如表5所示。螯合率同温度呈较为典型的峰状，以55 ℃为反应峰值，低于该温度时，螯合率随温度上升而增加，高于该温度时，螯合率随温度增加而降低，表明温度过高不利于螯合物的形成。由此确定55 ℃为最适螯合温度。

表4 酶解温度对多肽浓度的影响

表5 螯合温度对螯合率的影响

2.2.2 螯合时间对螯合率的影响

改变螯合时间，测定螯合率，结果如表6所示。螯合率随螯合时间增加而增加，当40 min后螯合率达到最大且保持稳定，表明40 min为最佳螯合时间。有研究表明：反应时间过长反而会导致螯合物释放矿物元素，发生解螯合效应[22-23]，故螯合时间不应过长。由此确定反应时间为40 min。

表6 螯合时间对螯合率的影响

2.2.3 起始pH对螯合率的影响

反应起始pH对螯合率的影响如表7所示。随着pH的增加，螯合率也随之增加，在pH为6.0时螯合率达到最大，随后螯合率反而下降。这是由于在pH较低条件下，氢离子同钙离子存在竞争关系，抢夺供电基团，阻碍螯合肽形成[24]，反之，当pH较高时，溶液中羟基基团又会形成不溶的氢氧化钙[25]。由此确定pH 6.0为最适pH。

2.2.4 肽钙比对螯合率的影响

螯合反应所加入的胶原多肽与氯化钙质量比对螯合率有显著影响。如表8所示，随着肽钙比的增加，螯合率也随之增加，当肽钙比为1∶1时螯合率达到最大值，继续增加肽钙比，螯合率不再增加。这是由于配位比对螯合率影响较为显著，不合适的料液比使得螯合物的供体数量不平衡，造成原料浪费，增加成本。由此确定1∶1为最适螯合比例。

表7 起始pH对螯合率的影响

表8 不同肽钙比对螯合率的影响

2.3 螯合肽的透射电镜结果

图3是金枪鱼骨胶原螯合肽在不同倍数下的透射电镜图。从图3中可知，大多数螯合肽虽个体较小（微米级别），但能清晰分辨。此外，研究还发现螯合肽的微结构同其分子量相关（图4），分子量过大则难以顺利螯合。这可能是由于部分活性肽存在侧链，对螯合具有一定的阻碍效应，使得活性肽无法顺利螯合钙离子。

2.4 螯合肽的粒度分析

图5是金枪鱼骨胶原螯合肽的粒径和数量的关系。在最佳螯合工艺条件下制备的螯合肽的粒径分布范围较窄，大部分螯合肽直径均低于1 μm，其中90%以上的螯合肽粒径分布范围为0.5～0.7 μm；螯合物粒径是其能否被吸收的关键。研究制备的螯合肽颗粒为微米级，不仅粒度小，而且具有较强乳化潜力，可完美融入各种食品体系中，赋予其优良的加工特性，为其在食品加工中的应用奠定了基础。

图3 金枪鱼骨胶原螯合肽在不同倍数下的透射电镜图（分子量约4 000 Da）

图4 金枪鱼骨胶原螯合肽在不同倍数下的透射电镜图（分子量约10 000 Da）

图5 螯合肽粒径与数量的关系

3 结论

结果显示，金枪鱼骨粉最佳酶解条件为：胰蛋白酶与风味蛋白酶复合比2∶1、pH 7.0、温度60 ℃。此时酶解鱼骨粉所得的胶原多肽含量最高。最佳螯合条件为：pH 6.0、螯合温度55 ℃、螯合时间40 min、胶原多肽与氯化钙质量比1∶1。此时螯合率最高，胶原多肽利用率也最高；此条件下制备的金枪鱼骨胶原螯合肽呈均匀的颗粒状分布，粒径分布范围0.5～0.7 μm，赋予其良好的食品加工特性。