高通量测序研究中药复方对流感病毒感染小鼠肠道菌群的影响

钟婧，张俊杰，李珂，叶贺贺，张淑静，葛东宇，吴莹

1.北京中医药大学生命科学学院，北京 100029；2.北京中医药大学中医学院，北京 100029

流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染性疾病，若治疗不及时，将引发严重的并发症甚至死亡。肠道独特的微生物群落可影响宿主抵御流感病毒的感染[1-3]。研究表明，小鼠感染流感病毒后，肠道菌群呈现失调状态[4-5]。Groves 等[6]发现，流感小鼠拟杆菌门增加、厚壁菌门减少；而Yildiz 等[7]研究表明，流感小鼠拟杆菌门数量减少、厚壁菌门增加。有报道，四君子汤对脾虚小鼠肠道菌群失调有明显改善作用[8-12]。我们前期研究发现，四君子汤、麻杏石甘汤、麻杏石甘汤合四君子汤均可改变正常小鼠肠道菌群的构成及比例[13]。本研究通过高通量测序，力图全面展示小鼠感染流感病毒后体内菌群变化，以观察药物对感染小鼠肠道菌群的影响。

1 实验材料

1.1 动物

SPF 级雄性Balb/C 小鼠25 只，体质量17～19 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号SCXK（京）2016-0011。饲养于北京中医药大学实验动物中心SPF 级动物房，温度（22±2）℃，相对湿度60%±10%，12 h/12 h 明暗周期，自由摄食饮水。

1.2 流感病毒株

甲型流感病毒鼠肺适应株PR8（A/PR/8/34），中国预防医学科学院病毒学研究所提供，本室-80 ℃保存。采用Reed Muench 法测定并计算其对小鼠的半数致死量（LD50）为10-5。

1.3 药物及制备

麻杏石甘汤（麻黄6 g，苦杏仁9 g，生石膏24 g，甘草6 g），麻黄和生石膏单独浸泡于蒸馏水中40 min，生石膏先煎30 min，加苦杏仁、甘草熬至水沸，小火煎煮15 min，加入麻黄，再煎煮5 min，倒出药液加水第2 次煎煮（煮沸后小火煎煮10 min），最后将2次药液混合浓缩至30 mL，制成含原药材1.5 g/mL 的药液。四君子汤（茯苓10 g，党参10 g，炙甘草10 g，白术10 g），饮片浸泡于蒸馏水中40 min，第1 次煎大火煮沸后，小火煎煮30 min，第2 次煎大火煮沸后，小火煎煮20 min，合并2 次煎药，浓缩，制成含原药材1.5 g/mL 药液。麻杏石甘汤合四君子汤:将制备的2 组汤药各取10.5 mL 混合并浓缩至10.5 mL。上述饮片均购自北京中医药大学国医堂，药物经煎煮、过滤、浓缩后，置于4 ℃冰箱保存备用。

1.4 主要试剂与仪器

土壤soil DNA 提取试剂盒（Omega Bio-Tek），PCR 扩增试剂盒（Trans Gen），2%琼脂糖凝胶、AxyPrepDNA 凝胶回收试剂盒（AXY GEN）。移液枪（Eppendorf），荧光实时定量PCR 仪（ABI），高速台式冷冻离心机（Eppendorf），小型离心机（Eppendorf），电泳仪（北京市六一仪器厂），Miseq测序仪（Illumina）。

2 实验方法

2.1 造模

将小鼠适应性饲养2～3 d。乙醚轻微麻醉小鼠，病毒组和各给药组予0.1 血凝素蛋白亚致死量流感病毒稀释液25 μL 滴鼻感染，建立小鼠亚致死量流感病毒感染模型；正常组给予等量无菌生理盐水滴鼻。

2.2 分组

小鼠按随机数字表法分为正常组、病毒组、麻杏石甘汤组（麻杏组）、四君子汤组（四君组）、麻杏石甘汤合四君子汤组（麻四组），每组5 只。正常组和病毒组给予无菌双蒸水灌胃，其余3 组分别给予相应药液灌胃，0.15 mL/次，2 次/d，各组于第4、7 日末次给药8 h 后，无菌条件取小鼠粪便，Illumina Miseq高通量测序检测各组药物对病毒感染小鼠肠道菌群的影响。

2.3 给药

感染1 h 后，正常组和病毒组给予无菌双蒸水灌胃，0.15 mL/次，2 次/d；其余3 组分别予相应药液灌胃，0.15 mL/次，2 次/d。均连续灌胃7 d。

2.4 样本采集

第4、7 日小鼠灌胃后8 h 取材。超净台紫外线照射并通风，将无菌滤纸置于台上，一只手固定小鼠颈部，另一只手在小鼠肛门处抚摸排便，使排出粪便掉落在无菌滤纸上；用镊子将粪便（粪便粒数≥3）夹到冻存管里，拧紧盖子，对样本编号，放入液氮保存。

2.5 高通量测序

DNA 提取试剂盒提取粪便DNA，对细菌16 s 核糖体RNA 基因V3～V4 区扩增，各样本均加8 bp 标签序列3 次扩增重复。扩增后凝胶回收试剂盒回收PCR 产物，随后用2%琼脂糖凝胶电泳检测。将电泳结果使用荧光定量，并构建Miseq 文库、Miseq 测序。

3 统计学方法

采用SPSS20.0 统计软件进行分析。组间比较用方差分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 流感小鼠模型建立评价

正常组小鼠毛发顺滑光亮，行动敏捷，反应灵敏，精神状态良好；病毒组小鼠毛发不顺滑无光泽，蜷缩不动，可听到小水泡样呼吸声，喘促明显，反应迟钝，精神状态差；四君组小鼠状态与病毒组相似；麻杏组和麻四组小鼠状态较病毒组好转，毛发有序，反应较灵敏，精神状态较好。

4.2 样本序列信息统计

经Illumina 测序，5 组50 个样本共获得2 893 730 条优化序列，平均每个样本57 875 条优化序列，优化序列平均长度为439。正常组共获得580 530 条优化序列，病毒组共获得601 617 条优化序列，四君组共获得564 877 条优化序列，麻杏组共获得566 150 条优化序列，麻四组共获得580 556 条优化序列。小鼠感染流感后，其样本优化序列总和在2 个时间段内较正常组均升高；四君组与麻杏组样本优化序列总和在2 个时间段内较病毒组均降低；麻四组样本优化序列总和在第4 日较病毒组降低，而在第7 日升高。各组样本序列详见表1。

4.3 药物对流感小鼠菌群丰富度和多样性的影响

4.3.1 Alpha 多样性分析

通过单样本Alpha 多样性分析反映微生物群落的丰富度和多样性，包括一系列统计学分析指数估计环境群落的物种丰度和多样性。反映群落丰富度（community richness）的指数有Ace 指数、Chao 指数、Sobs 指数；反映群落多样性（community diversity）的指数有Shannon 指数、Simpson 指数；反映群落覆盖度（community coverage）的指数有Coverage 指数。上述指数中，Shannon 指数值越大，说明群落多样性越高；Simpson 指数值越大，说明群落多样性越低；Coverage 指数是各样本文库的覆盖率，其数值越高，则样本中序列被测出的概率越高，而未被测出的概率越低，该指数反映本次测序结果是否代表样本中微生物的真实情况。各样本多样性指数见表2。对比感染流感病毒小鼠和正常小鼠发现，随着时间的变化，尤其是第7 日，各样本数呈现不同程度的变动。说明小鼠感染流感病毒后，肠道菌群比例、菌群丰富度和多样性发生变化。

表1 各组样本序列总和不同时点比较

表2 各组小鼠肠道菌群样本多样性指数比较

续表2

4.3.2 稀释曲线分析

稀释曲线（rarefaction curve）可用来比较测序数据量不同样本中物种的丰富度、均一性或多样性，也可用来说明样本的测序数据量是否合理。如图1 所示，Shannon-Wiener 曲线趋向平坦时，说明测序数据量足够大，可反映样本中绝大多数微生物多样性信息，Shannon 指数值越大，说明群落多样性越高。感染病毒后，小鼠菌群Shannon 指数在第4 日较正常组升高，第7 日较正常组降低，说明小鼠感染流感病毒后，第4 日菌群群落多样性增加，而第7 日多样性减少。四君组、麻杏组与麻四组小鼠感染后第4、7 日，各组Shannon 指数较病毒组均降低，其菌群多样性均减少。表明流感病毒感染会影响正常小鼠菌群多样性，各药物使用对病毒感染小鼠肠道菌群的多样性产生影响。

4.4 药物对流感小鼠肠道菌群相似度的影响

通过物种韦恩图（Venn dia gram）分析，可比较各组间独有和共有的OTU 数目，进而比较多个样本群落间组成的相似度与重叠关系。如图2 所示，病毒组和正常组感染第4、7 日共有的OTUs 数目分别为626、627，正常组独有的OTUs 数目分别为32、24，病毒组独有的OTUs 数目分别为36、30；病毒组和四君组感染第4、7 日共有OTUs 数目分别为631、615，病毒组独有的OTUs 数目分别为31、42，四君组独有的OTUs 数目分别为31、30；病毒组和麻杏组感染第4、7 日共有的OTUs 数目分别为624、622，病毒组独有的OTUs 数目分别为38、35，麻杏组独有的OTUs数目分别为28、31；病毒组和麻四组感染第4、7 日共有的OTUs 数目分别为627、623，病毒组感染第4、7 日，独有的OTUs 数目分别为35、34，麻四组感染第4、7 日独有的OTUs 数目分别为355、34。结果显示，流感病毒感染小鼠后，随着给药时间的延长，各给药组和病毒组间共有的OOTUs 数目均减少，其中，病毒组和四君组间共有的OOTUs 数目减少最多，其菌群相似性变化也最明显。

图6 病毒组和正常组小鼠肠道菌群显著性差异图

图7 病毒组和四君组小鼠肠道菌群显著性差异图

图8 病毒组和麻杏组小鼠肠道菌群显著性差异图

图9 病毒组和麻四组小鼠肠道菌群显著性差异图

表3 病毒组和正常组不同时间段显著性差异菌属变化情况

表4 各药物组与病毒组不同时间段显著性差异菌属变化情况

图6 所示，病毒感染第4 日，正常组和病毒组在属分类学水平上有4 种细菌表现出显著差异，病毒组Tyzzerella 显著增加，Eubacterium_Ventriosum_ group、Faecalitalea、norank_f_Christensenellaceae 显著减少。感染第7 日，有16 种菌属在正常组和病毒组间表现出显著差异，病毒组Alloprevotella 拟普雷沃菌属、Rumiclostridium 、 norank_f_ Ruminococcaceae 、Anaerotruncus、Parabacteroides、Oscillibacter 颤螺旋菌属、Peptococcus 消化球菌属、Tyzzerella、unclassified_f_Prevotellaceae、Bilophila 嗜胆菌属显著增加，Ruminococcaceae_UC G_014、Lactobacillus 乳杆菌属、Anaerofustis、Eubacterium_Ventriosum_ group、norank_o_Mollicutes_ RF9、Candidatus_Arthromitus 分段丝状细菌显著减少。

图7 所示，病毒感染第4 日，病毒组和四君组在属分类学水平上有12 种细菌表现出显著差异，四君组Ruminococcaceae_UC G_014、Ruminococcaceae_UC G_002、norank_f_Coriobacteriaceae、norank_f_Christensenellaceae、Parasutterella 帕拉萨特菌属、norank_f_Rhodospirillaceae、Eubacterium_Ventriosum_group 显 著 增 加， norank_f_Lachnospiraceae 、Peptococcus 消化球菌属、Tyzzerella、Candidatus_Arthromitus 分 段 丝 状 细 菌 、 norank_f_Ruminococcaceae 显著减少。感染第7 日，有16 种菌属在病毒组和四君组间表现出显著差异，四君组Ruminococcaceae_UC G_014 、 Akkermansia 、Parasutterella 帕 拉 萨 特 菌 属 、 norank_f_Coriobacteriaceae、 Ruminococcaceae_UC G_005、norank_f_Christensenellaceae 、 Enterorhabdus 、Desulfovibrio 脱硫弧菌属、Eubacterium_Ventriosum_group 显 著 增 加， Rumiclostridium 、 norank_f_Clostridiales_vadinBB60_group、norank_f_Ruminococcaceae、Anaeroplasma、Oscillibacter 颤螺旋菌属、Peptococcus 消化球菌属、Tyzzerella 显著减少。

图8 所示，病毒感染第4 日，病毒组和麻杏组在属分类学水平上有12 种细菌表现出显著差异，麻杏组 Eubacterium_Ventriosum_ group 显著增加，norank_f_Lachnospiraceae 、 Rumiclostridium 、Marvinbryantia 、 Desulfovibrio 脱硫弧菌属、Anaerotruncus、Candidatus_Arthromitus 分段丝状细菌、 Oscillibacter 颤螺旋菌属、 norank_f_Ruminococcaceae 、 Blautia 、 Ruminococcaceae_UC G_009、Tyzzerella 显著减少。感染第7 日，有9 种菌属在病毒组和麻杏组间表现出显著差异，麻杏组Ruminococcaceae_UC G_014、Subdoli granulum、Rhodococcus、Ruminococcaceae_NK4A214_ group、Anaerofustis、Parasutterella 帕拉萨特菌属显著增加，norank_f_Lachnospiraceae、unclassified_f_Lachnospiraceae、Blautia 显著减少。图9 所示，病毒感染第4 日，病毒组和麻四组在属分类学水平上有10 种细菌表现出显著差异，麻四组Bacteroides 拟杆菌属、unclassified_o_Clostridiales、Eubacterium_Ventriosum_ group 显著增加， Eisenber giella 、 Ruminococcaceae_UC G_009 、 Blautia 、 Eubacterium_xylanophilum_ group、Peptococcus 消化球菌属、Tyzzerella、Butyricicoccus 显著减少。感染第7 日，有19 种菌属在病毒组和麻四组间表现出显著差异，麻四组 Ruminococcaceae_UC G_014、Anaerofustis、Parasutterella 帕拉萨特菌属显著增加， norank_f_Ruminococcaceae 、 Anaerovorax 、Lachnoclostridium、Family_XIII_UC G_001、Blautia、 Oscillibacter 颤螺旋菌属、 Anaerotruncus 、 unclassified_o_Clostridiales 、 Ruminiclostridium_9 、Tyzzerella 、 Butyricicoccus 、 Coprococcus_1 、 Lachnospiraceae_FCS020_ group、Bilophila 嗜胆菌属、Defluviitaleaceae_UC G_001、Peptococcus 消化球菌属显著减少。

5 讨论

高通量测序结果表明，小鼠感染流感病毒后，肠道菌群比例失调，菌群丰度及多样性会发生变化；药物干预后，各药物组小鼠肠道菌群微生物多样性异于病毒组小鼠。

短链脂肪酸（SCFA）在炎症反应及免疫系统的调节中发挥了重要作用[14-15]。研究显示，肠道菌群中的特定菌属能增强抗炎Treg 或者促炎Th17 细胞的生成，从而影响炎症反应，正是肠道菌群的代谢产物SCFA 介导了肠道菌群与免疫系统间的交流，影响促炎与抗炎机制之间的平衡[16-17]。

在优势菌属上，感染流感病毒后，2 个时间段病毒组小鼠Ruminococcaceae_UC G_014 菌属均不再是占比最高的四大菌属之一，其占比较正常组下降约4%；感染第 4 日，病毒组中 Lachnospiraceae_NK4A136_ group 占比较正常组下降1.35%。仅从肠道优势菌属变化出发，可初步说明流感病毒感染，造成病原菌升高、SCFAs 产生相关菌属降低，引起肠道菌群的失调。

在属水平显著差异上，病毒感染第7 日，病毒组诱导免疫应答所必需的共生菌 Candidatus_Arthromitus 分段丝状细菌、益生菌Lactobacillus 乳杆菌属显著减少，与心血管疾病风险相关的Tyzzerella在2 个时间段内均显著增加。与SCFAs 产生相关的细菌，在病毒感染第4 日，Eubacterium_Ventriosum_group 显著降低；病毒感染第7 日，Anaerofustis、Eubacterium_Ventriosum_ group、Ruminococcaceae_UC G_014 显著减少，而同为丁酸产生相关菌属Anaerotruncus、Alloprevotella拟普雷沃菌属显著增加。

在优势菌属上，四君组 Ruminococcaceae_UC G_014 再成为2 个时间段占比最高的四大菌属之一，其占比较病毒组均升高，而四君组中丁酸盐产生菌Alloprevotella 拟普雷沃菌属占比在病毒感染第7 日较病毒组降低2.72%，由于有机体会竞争相同的底物或者形成抑制物质，因此，Alloprevotella 拟普雷沃菌属的变化与Ruminococcaceae_UC G_014 此类产丁酸的细菌呈相反趋势是合理的。麻杏组Ruminococcaceae_UC G_014 的变化情况与四君组一致。麻杏组Alloprevotella 拟普雷沃菌属在感染第4 日较病毒组增加，却在感染第7 日略下降。麻四组Ruminococcaceae_UC G_014 占比2 个时间段较病毒组分别增加2.62%、11.03%。

四君组在感染第4 日，Candidatus_Arthromitus分段丝状细菌、病原菌Tyzzerella 显著减少；在感染第7 日，Akkermansia、Desulfovibrio 脱硫弧菌属、Enterorhabdus 显著性增加，病原菌Oscillibacter 颤螺旋菌属及Tyzzerella 显著减少；麻杏组在感染第4 日，Candidatus_Arthromitus 分段丝状细菌、病原菌Desulfovibrio 脱硫弧菌属、Oscillibacter 颤螺旋菌属、Tyzzerella 显著减少；麻四组在感染第4 日，病原菌Tyzzerella 显著减少；感染第7 日，病原菌Oscillibacter颤螺旋菌属、Tyzzerella 在麻四组中显著减少，说明四君子汤与麻杏石甘汤合用，会使病毒感染小鼠肠道的病原菌显著降低。

通过对比以上实验结果发现，各药物均对病毒感染造成的肠道菌群失调产生影响，丁酸产生菌科的Ruminococcaceae_UC G_014 在病毒组小鼠中显著降低，各药物的应用使该菌属重新成为占比最高的四大菌属之一；而麻杏石甘汤合四君子汤对肠道菌群的影响不仅是2 个单方作用的叠加:在各组占比最高的四大菌属中，与SCFAs 产生相关的优势菌属不尽相同，如病毒感染第4 日，除Ruminococcaceae_UC G_014外，Unclassified_f_Lachnospiracea 是四君组中四大菌属之一，Alloprevotella 拟普雷沃菌属是麻杏组四大菌属之一，而麻四组中的四大优势菌属之一则是Prevotellaceae_UC G_001。

流感病毒感染会使小鼠病原菌 Alistipes、Tyzzerella 增加，益生菌分段丝状细菌、乳杆菌减少，与SCFAs 产生相关的菌属减少，引起严重的失调。四君子汤、麻杏石甘汤、麻杏石甘汤合四君子汤的使用会不同程度地改善流感引起的这种失调状态:对流感小鼠而言，四君子汤可降低病原菌 Alistipes、Tyzzerella 等的含量、使益生菌Akkermansia 增加；麻杏石甘汤可使病原菌脱硫弧菌属、颤螺旋菌属和Tyzzerella 数量减少的同时引起病原菌Alistipes 的增加，对流感小鼠的肠道菌群造成显著影响；麻杏石甘汤合四君子汤使病原菌Tyzzerella 和颤螺旋菌属显著下降。此外，四君子汤与麻杏石甘汤单独使用第4 日均引起病毒小鼠肠道内益生菌分段丝状细菌数量下降，而四君子汤与麻杏石甘汤的联合使用抑制了分段丝状细菌减少与Alistipes 增加的趋势。不管在正常小鼠还是流感小鼠模型上，麻杏石甘汤均增加Alistipes的占比，说明某些清热类中药药性苦寒，可能对菌群有一定的“毒性”作用，在抑制某些益生菌的同时也会引起病原菌的增加，而四君子汤可中和这种毒副作用。另外，各组药物应用与SCFAs 产生相关菌属发生复杂变化。

综上，本研究建立流感小鼠模型，通过Illumina Miseq 高通量测序技术对样本各项指数测序，确立流感小鼠、服用各药物小鼠的肠道菌群多样性和结构发生不同程度变化。使用LEfSe 软件对各组小鼠肠道特定菌群分类，最终通过对比分析，探讨四君子汤、麻杏石甘汤、麻杏石甘汤与四君子汤合用对病毒感染小鼠肠道菌群种类数量的变化，明确不同汤药对流感小鼠的作用。

通过实验我们发现，各药物的应用使小鼠肠道菌群发生结构及比例的变化:四君子汤可通过增加益生菌的含量而对肠道菌群产生较为温和的影响，麻杏石甘汤对肠道菌群的影响更为显著；麻杏石甘汤与四君子汤合用可增加益生菌、减缓病原菌增加的趋势，而且合方的应用产生与单方不同的变化。此外，四君子汤、麻杏石甘汤合四君子汤的应用可显著增加与SCFAs 产生相关的菌属。