HPLC法对壮瑶药狗仔花中绿原酸和咖啡酸含量的测定

郭海姣 刘进宝 胡华 王先军 刘雯

摘要：建立一种同时测定壮瑶药狗仔花中咖啡酸和绿原酸含量的HPLC方法。色谱柱为Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相为乙腈-0.2%磷酸水溶液，梯度洗脱;流量为1.0 mL/min;检测波长为327 nm;柱温为25 ℃。结果表明，绿原酸和咖啡酸分别在47.84～239.2 μg/mL（R=0.999 8）、10.05～50.25 μg/mL（R=0.999 9）呈现良好的线性关系，平均加样回收率分别为96.69%、102.10%，RSD分别为0.74%、2.00%。试验建立了HPLC法测定狗仔花中绿原酸、咖啡酸含量的方法，该方法准确、灵敏、可靠，重现性较好，可用于壮瑶药狗仔花的质量控制。

关键词：狗仔花;绿原酸;咖啡酸;HPLC

中图分类号：O657.7+1;S567.21+9 文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2020）07-0188-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2020.07.038

Abstract： To establish a method for the determination of caffeic acid and chlorogenic acid Vernonia patula by HPLC. The separation was performed on Welch Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）with the acetonitrile-0.2% phosphoric acid aqueous solution as the mobile phase with gradient elution. The volume flow rate was 1.0 mL/min. The detection wavelength was 327 nm. The column temperature was 25 ℃. The linear range of caffeic acid and chlorogenic acid were 47.84～239.2 μg/mL（R=0.999 8）、10.05～50.25 μg/mL（R=0.999 9），and the average recoveries （n=6） were 96.69%（RSD=0.74%）、102.10%（RSD=2.00%）. This paper established a method for the contents of chlorogenic acid and caffeic acid in Vernonia patula. The method is accurate，sensitive，credible and repeatable. It can be applied to the quality control of Vernonia patula.

Key words： Vernonia patula; chlorogenic acid; caffeic acid; HPLC

狗仔花系菊科斑鸠菊属植物咸虾花（Vernonia patula）的全草，主产于中国福建、台湾、广东、广西、贵州、云南等省区，资源丰富。狗仔花是传统壮瑶药，应用历史悠久，具有发表散寒、凉血解毒、清热止泻之功效，主要用于感冒发热、疟疾、热泻、痧气、湿疹、荨麻疹、久热不退、高血压、乳腺炎等[1]，临床疗效显著，应用范围较广。目前国内外学者对斑鸠菊属植物的研究较多，通过研究发现其主要成分为倍半萜类、三萜、黄酮、甾体、挥发油等，展现了多方面的药理活性，如抗肿瘤、抗真菌、抗疟等[2]。但对斑鸠菊属植物咸虾花研究较少，其中有部分学者對其化学成分进行了研究，分离得到了苯丙素类化合物和倍半萜类化合物[3-5];有学者对其药理作用进行了研究，认为狗仔花具有抗炎与抗氧化活性[6]。

中药是中国传统医药的重要组成部分，是中医临床防病治病的最主要物质手段。中药质量标准的不完善是阻碍中药产业走向现代化与国际化的障碍。中药质量标准研究一直是中药发展的关键，决定着中药的安全性和有效性[7]。在《广西壮族自治区壮药标准》第三卷及《广西壮族自治区瑶药材质量标准》第一卷中，均收录了狗仔花，但该标准中质量控制项目只有性状鉴别项，难以全面地控制狗仔花的质量，因此，为了保证狗仔花临床应用的有效性与安全性，完善狗仔花的质量标准势在必行。试验拟通过HPLC法测定其绿原酸、咖啡酸含量，为狗仔花质量评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试药

Agilent 1260高效液相色谱仪，包括UV型紫外检测器、安捷伦工作站（美国安捷伦公司）;密思博超纯水器;SQP十万分之一电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司）;TGL-16G离心机（上海安亭科学仪器厂）;KQ5200B型超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。水为纯净水;甲醇为分析纯;乙腈为色谱纯。试验用对照品绿原酸（批号110753-201716，含量99.3%）和咖啡酸（批号110885-201703，含量99.7%）购自中国食品药品检定研究院。狗仔花（批号：20160401、20161101、20170101）均由广西中医药大学制药厂提供，经广西中医药大学中药鉴定教研室谭勇教授鉴定为菊科斑鸠菊属植物咸虾花。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Welch Ultimate XB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相乙腈（A）-0.2%磷酸水（B）;梯度洗脱（0～10 min，10%～20%A;10～15 min，20%～25%A;15～20 min，25%～100%A;20～25 min，100%～100%A）;流速1.0 mL/min;检测波长327 nm;供试品溶液进样量10 μL，对照品溶液进样量5 μL;柱温25 ℃。

1.2.2 溶液的制备

1）对照品溶液的制备。精密称取绿原酸对照品粉末9.20 mg于10 mL容量瓶中，加适量甲醇使其完全溶解，再加甲醇定容摇匀，即得绿原酸储备液;同上述方法精密称取咖啡酸对照品粉末6.70 mg于10 mL容量瓶中并定容，得咖啡酸储备液。依次精密量取绿原酸储备液2.6 mL、咖啡酸储备液0.75 mL，置于同一个5 mL的棕色容量瓶中，甲醇定容，摇匀，即得含绿原酸478.4 μg/mL、咖啡酸100.5 μg/mL的对照品混合溶液。

2）供试品溶液的制备。精密称取狗仔花粗粉（过2号筛）约5 g，置带塞磨口锥形瓶中，用移液管精密量取25 mL 75%甲醇倒入锥形瓶，称重，超声处理20 min，放凉，用75%甲醇补足失重，摇匀，滤过。取上清液过0.45 μm微孔滤膜即得。

1.3 方法学考察

1.3.1 线性关系考察 用移液管分别精密移取“1.2.2”制备的对照品混合溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀释并定容至刻度，制得一系列不同浓度的对照品混合溶液。分别取适量上述对照品混合溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，按“1.2.1”的检测洗脱条件进样分析。以对照品峰面积为纵坐标，对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。

1.3.2 精密度试验 取对照品混合溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，上机测定，重复进样6次，记录峰面积，计算被测组峰面积RSD值。

1.3.3 重复性试验 精密称取狗仔花粗粉（过2号筛，批号：20160401）约5 g，平行称取6份，得到狗仔花供试品溶液。按“1.2.1”条件测定，记录被测组分峰面积RSD值。

1.3.4 稳定性试验 供试品溶液在配制后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，按“1.2.1”测定，记录被测组色谱峰面积，计算被测组峰面积RSD值。

1.3.5 加样回收率试验 精密称取狗仔花粗粉（过2号筛，批号：20160401）2.5 g，平行称取6份样品，按照相当于样品中含量100%的比例分别精密加入对照品适量，按“1.2.1”条件测定，记录被测组峰面积，计算平均回收率。

2 结果与分析

2.1 系统适用性试验

分别精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液5、10 μL按“1.2.1”色谱条件进样测定，结果如图1所示，理论板数以绿原酸计≥3 000。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系考察 用移液管分别精密移取“1.2.2”制备的对照品混合溶液1、2、3、4、5 mL置于10 mL棕色容量瓶中，定容。分别取适量上述不同浓度对照品混合溶液，经0.45 μm微孔滤膜滤过，取滤液，按“1.2.1”进样分析。以被测组分峰面积为纵坐标（Y），以对照品质量浓度（μg/mL）为横坐标（X），绘制标准曲线。计算得绿原酸线性回归方程为Y=1 781.7X+807.34，相关系数0.999 8;咖啡酸线性回归方程为Y=3 933.3X+13.86，相关系数0.999 9，说明绿原酸、咖啡酸质量浓度分别在47.84～239.2、10.05～50.25 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 取对照品混合溶液经0.45 μm微孔滤膜过滤，上机测定。按“1.2.1”方法重复进样6次，记录被测组峰面积，计算被测组绿原酸、咖啡酸峰面积RSD值分别为0.41%、0.13%，说明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 平行称取6份狗仔花粗粉（过2号筛，批号：20160401），每份5 g，按“1.2.1”方法进行分析，记录被测组峰面积，计算得绿原酸平均含量为0.026 2%，RSD值为2.7%;咖啡酸平均含量为0.007 0%，RSD值为2.8%，说明试验所建立的方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取适量供试品溶液，在配制后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL进行测定，记录被测组色谱峰面积，计算被测组峰面积RSD值。测得到绿原酸、咖啡酸的RSD值分别为2.1%、2.8%，表明该方法制得的狗仔花供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.5 加样回收率 平行称取6份狗仔花粗粉（过2号筛，批号：20160401），每份約2.5 g，按照相当于样品中含量100%的比例分别精密加入对照品适量，按“1.2.1”方法进行分析，记录被测组峰面积，计算平均回收率，结果见表1。通过计算得到狗仔花中绿原酸平均回收率为96.69%，RSD值为0.74%;咖啡酸平均回收率为102.10%，RSD值为2.00%，表明加样回收率良好。

2.3 样品测定

取3批不同批次的狗仔花样品，按“1.2.2”方法提取;按“1.2.1”方法进行分析，结果见表2。由表2可以看出，不同批次狗仔花绿原酸、咖啡酸含量相差较大，说明狗仔花的质量差异较大，应该严格控制狗仔花的质量。

3 讨论

狗仔花是传统壮瑶药，临床应用广泛。完善狗仔花的质量标准对保证狗仔花临床应用、推广狗仔花的临床应用和资源开发具有重要意义。关于狗仔花指标性成分的含量测定研究鲜有报道，试验建立了HPLC法对狗仔花中绿原酸、咖啡酸含量进行测定，该方法能够有效控制狗仔花中绿原酸、咖啡酸的含量，且简便可行，耗时较短，结果准确，重复性好。

参考文献：

[1] 广西壮族自治区食品药品监督管理局. 广西壮族自治区壮药质量标准（第三卷）[M]. 南宁：广西科学技术出版社，2017.

[2] 邱 潍，陈 新，章 慧. 咸虾花的化学成分研究[J]. 安徽农业科学，2018，46（4）：181-183.

[3] 孙 力，巴玉兰，于鲁海，等. 斑鸠菊属植物药理活性研究进展[J]. 新疆中医药，2009，27（6）：82-85.

[4] 梁侨丽，闵知大. 咸虾花化学成分的研究[J]. 中国中药杂志，2003（3）：46-48.

[5] 梁侨丽，蒋继宏，闵知大. 咸虾花中的牻牛烷型倍半萜内酯[J]. 中国天然药物，2010，8（2）：106-109.

[6] HIRA A，DEY S K，HOWLADER M S，et al. Anti-inflammatory and antioxidant activities of ethanolic extract of aerial parts of Vernonia patula （Dryand） Merr[J].Asian pacific journal of tropical biomedicine，2013，3（10）：798-805.

[7] 佘一鸣，胡永慧，韩立云，等. 中药质量控制的研究进展[J]. 中草药，2017，48（12）：2557-2563.