年轻Sca-1+骨髓干细胞对年老小鼠血管平滑肌细胞增殖能力的调控作用及机制*

董珺， 曾波航， 田朝伟， 莫沛， 刘建卫， 熊龙根， 黎佼△

广州医科大学附属第二医院 1肿瘤科， 2心内科(广东广州 510260)

我们前期的研究表明：通过年轻小鼠骨髓细胞重建年老小鼠骨髓，可再生心肌梗死后年老小鼠心脏功能。年轻骨髓细胞可以通过旁分泌等分子机制增加年老小鼠心肌梗死后细胞存活，促进细胞增殖以及血管再生[1]。进一步研究发现，Sca-1+骨髓干细胞在重建年老小鼠心脏中表达升高最明显[2]。通过年轻Sca-1+骨髓干细胞重建年老小鼠骨髓，可通过旁分泌转化生长因子-β1(TGF-β1)，促进心外膜细胞上皮间质转化，最终改善心肌梗死后年老小鼠心脏功能[3-4]。最新的研究证实，衰老同样影响了血管平滑肌细胞(VSMC)的功能[5]。VSMC的衰老，是动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭等心血管疾病的重要诱因[6-7]。然而年轻Sca-1+骨髓干细胞对年老小鼠血管平滑肌细胞(old mice vascular smooth muscle cell， OMVSMC)的作用及其机制研究少见报道。为此，2017年1月至2019年11月，本研究探讨了年轻Sca-1+骨髓干细胞对OMVSMC增殖的调控作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 不同年龄段小鼠细胞提取 选取2～3个月月龄C57BL/6小鼠作为年轻组(Y组)。选取22～23个月月龄C57BL/6小鼠作为年老组(O组)。提取Y组小鼠骨髓细胞，Y组及O组小鼠VSMC。

1.1.2 主要试剂及仪器 Sca-1+细胞分选试剂盒(Stem Cell Technology)；BrdU(Sigma)；血小板源生长因子B链的纯合二聚体(PDGFBB)ELISA检测试剂盒(R&D)；MTT细胞增殖检测试剂盒(Abcam)；平滑肌肌动蛋白(α-SMA)荧光染色(Sigma)；Transwell室(Corning)；荧光定量PCR仪(ABI)。

1.2 方法

1.2.1 年轻Sca-1+细胞的提取及鉴定 按照Sca-1+细胞分选试剂盒使用方法，收集Y组小鼠股骨，提取小鼠骨髓细胞，通过分选试剂盒，分选Sca-1+及Sca-1-细胞，并通过流式细胞仪鉴定Sca-1+细胞比例[3]。

1.2.2 MVSMC培养 收集Y组及O组小鼠主动脉，分离消化后，培养MVSMC。并通过α-SMA荧光染色鉴定细胞[3， 8]。

1.2.3 细胞增殖检测 BrdU染色及MTT细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖能力。

1.2.4 qRT-PCR检测 收取OMVSMC总RNA，通过qRT-PCR检测不同实验组中cyclin B1、cyclin D1基因的表达。选取GAPDH作为内参对照。各基因引物见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.5 Western blot检测 收取OMVSMC蛋白，通过Western blot检测不同实验组中cyclin B1、cyclin D1蛋白的表达。选取GAPDH作为内参对照。

1.2.6 年轻Sca-1+/-细胞分别与OMVSMC共培养 Y组Sca-1+/-细胞分别培养于Transwell小室滤膜上方，OMVSMC培养于Transwell下室。无血清，低氧(0.1% O2)培养72 h，行BrdU染色检测增殖细胞。提取OMVSMC总RNA及蛋白，检测增殖相关基因及蛋白的表达。收集Y组Sca-1+/-细胞上清分别与OMVSMC共培养。1%血清，低氧培养7 d。分别于第1、3、5、7天，收取OMVSMC，通过MTT细胞增殖检测试剂盒检测细胞增殖能力。

1.2.7 年轻Sca-1+/-细胞旁分泌生长因子鉴定 无血清，低氧培养(0.1% O2)72 h后，分别收集Y组Sca-1+/-细胞及上清。参照PDGFBB ELISA 检测试剂盒使用方法，检测细胞及上清中PDGFBB的表达。

注：体外培养年轻(Y)及年老(O)VSMC图1 α-SMA染色鉴定细胞类型

2 结果

2.1 不同年龄组MVSMC增殖能力检测 培养MVSMC，并通过α-SMA荧光染色，鉴定细胞形态及类型，见图1。与Y组相比，O组MVSMC增殖细胞(BrdU染色阳性)比例下降71%，见图2、表2；增殖相关基因cyclin B1表达下降67%，cyclin D1表达下降57%；增殖相关蛋白cyclin B1表达下降60%，cyclin D1表达下降46%；MTT检测细胞增殖，与Y组相比，O组MVSMC在第3、5、7天，细胞增殖能力下降，见图3、表2。

注：A:Y组；B:O组

图3 Western blot检测增殖相关蛋白(cyclin B1，cyclin D1)表达

表2 不同年龄组MVSMC增殖能力、增殖相关基因及蛋白表达检测

2.2 年轻Sca-1骨髓干细胞对OMVSMC增殖能力的调控作用 与Sca-1-细胞共培养组比较，Sca-1+细胞共培养组，增殖细胞(BrdU染色阳性)比例上升2.6倍(图4、表3)；增殖相关基因cyclin B1表达上升2.27倍，cyclin D1表达上升2.47倍；增殖相关蛋白cyclin B1表达上升2.43倍，cyclin D1表达上升2.73倍(图5、表3)；MTT检测细胞增殖，证实与Sca-1-细胞共培养组相比，Sca-1+细胞共培养组，在第3、5、7天，细胞增殖能力上升，见表3。

注：A： O+Y Sca-1-组；B:O+Y Sca-1+组

表3 年轻Sca-1骨髓干细胞对OMVSMC增殖能力、增殖相关基因及蛋白表达的调控作用

图5 Western blot检测年轻Sca-1骨髓干细胞相关蛋白表达

2.3 年轻Sca-1骨髓干细胞旁分泌生长因子检测 与Sca-1-细胞比较，Sca-1+细胞中，Pdgfb基因表达上升2.49倍，PDGFBB的表达上升2.7倍。与Sca-1-细胞上清相比，Sca-1+细胞上清中PDGFBB的表达上升3.31倍，见表4。

表4 年轻Sca-1骨髓干细胞旁分泌生长因子检测

2.4 年轻Sca-1骨髓干细胞促进OMVSMC增殖的机制 中和年轻Sca-1+细胞旁分泌的PDGFBB。与Sca-1+细胞共培养对照组相比，中和PDGFBB组，增殖细胞(BrdU染色阳性)比例下降66%(图6、表5)；增殖相关基因cyclin B1表达下降63%，cyclin D1表达下降68%；增殖相关蛋白cyclin B1表达下降45%，cyclin D1表达下降58%(图7、表5)；MTT检测细胞增殖，与对照组比较，中和PDGFBB组，在第3、5、7天，细胞增殖能力下降，见表5。

注：A:O+Y Sca-1++C组；B:O+Y Sca-1++N组

图7 Western blot检测中和后年轻Sca-1骨髓干细胞相关蛋白的表达

表5 OMVSMC增殖能力、增殖相关基因及蛋白表达检测

3 讨论

衰老影响了机体内源性干细胞/祖细胞的功能，衰老成为再生医学研究的热点问题[9]。衰老同样影响了VSMC的增殖、迁移能力，以及细胞周期调控因子、衰老相关蛋白/酶的表达[6]。在Sca-1+骨髓干细胞的前期研究中，证实年轻Sca-1+骨髓干细胞可通过旁分泌改善年老心外膜细胞及血管内皮细胞功能，再生心肌梗死后年老小鼠心脏功能[8]。但年轻小鼠Sca-1+骨髓干细胞对OVSMC功能的调控作用研究甚少。所以本研究探讨了年轻小鼠Sca-1+骨髓干细胞对OVSMC功能的调控作用，研究发现年轻小鼠Sca-1+骨髓干细胞可通过旁分泌PDGFBB促进OVSMC增殖。

Sca-1+干细胞在心肌损伤修复中起重要作用，Sca-1+细胞被证实可调控细胞黏附、增殖及分化[10]。Sca-1+细胞缺乏可导致小鼠心脏收缩缺陷和年龄相关的心肌肥大[11]。在心脏中过表达Sca-1可减轻心肌肥大和纤维化，恢复心脏功能[12]。更有研究证实，在心肌梗死后，Sca-1+干细胞可以被招募到新生鼠及成年小鼠心脏，从而发挥修复作用[13]。在Sca-1+心脏干细胞中的研究也同样证实，将Sca-1+心脏干细胞移植于心肌梗死后心脏，可减小心梗范围，恢复左室心脏功能，促进新生血管生成[14]。我们的前期研究证实，与Sca-1-细胞相比，Sca-1+骨髓干细胞可以更好地改善心肌梗死后小鼠心脏功能[3]。进一步机制研究发现，与Sca-1-细胞相比，Sca-1+细胞可以旁分泌更多的生长因子，其中包括PDGFBB[2-3]。本研究，我们进一步证实了年轻Sca-1+骨髓干细胞旁分泌PDGFBB再生OVSMC增殖能力的作用。

研究证实，衰老影响了VSMC的功能，并导致了衰老相关血管疾病的发生[15]。在大鼠、小鼠和人来源VSMC的研究中证实，衰老导致VSMC的增殖能力下降[16-17]。Ruiz-Torres等[18]的研究证实，人来源VSMC的迁移能力也随年龄的增加而下降。同样地，随年龄增加，小鼠和人来源VSMC凋亡比例增加[16， 19]。MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、MMPs等炎症相关因子在VSMC中的表达也随年龄的增加而发生改变[20]。本研究我们证实，随年龄增加，MVSMC增殖相关基因及蛋白表达下降，细胞增殖能力下降。而通过年轻Sca-1+骨髓干细胞与OVSMC共培养，恢复了OVSMC的增殖能力。这为年轻Sca-1+骨髓干细胞在再生医学中的运用，提供了更多的实验数据。也为VSMC衰老导致的动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭等心血管疾病的治疗提供了更多的治疗手段。

PDGF家族被证实可调控VSMC功能，调控血管形成[21]。其中PDGFBB更是被证实参与VSMC表型的转化、细胞增殖及细胞迁移能力的调控[22]。本研究我们证实，与Sca-1-细胞相比，Sca-1+细胞可以旁分泌更多的PDGFBB，从而促进OVSMC增殖。中和Sca-1+细胞分泌的PDGFBB，使Sca-1+失去促进OVSMC增殖的作用。所以我们证实，年轻小鼠Sca-1+骨髓干细胞可通过旁分泌PDGFBB促进OVSMC增殖。

综上所述，年轻小鼠Sca-1+骨髓干细胞可通过旁分泌PDGFBB促进OVSMC增殖相关基因及蛋白的表达，促进细胞增殖。本研究进一步阐述了年轻Sca-1+骨髓干细胞对年老小鼠细胞功能的影响及分子机制，为干细胞在衰老相关疾病中运用提供了更多的实验基础。