顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用对水塔陈醋挥发性风味成分的分析

杨馥秀,周考文,2,*

(1.北京联合大学生物化学工程学院,北京 100023;2.生物质废弃物资源化利用北京市重点实验室,北京 100023)

食醋早在我国西周时期就己出现,是一种发酵的酸味液态调味品,多由糯米、高梁、大米、玉米、小麦以及糖类和酒类发酵制成,因有着浓郁的特殊香气成分以及含有丰富的营养价值[1-2]而成为餐桌上不可或缺的重要调味料品。食品的气味种类繁杂,容易变化,不同的原料、产地、气候以及酿造工艺,使食醋的风味以及口感千差万别,因此食醋的气味成为影响消费者接受度和满意度的一个重要因素,食品气味主要涉及挥发性物质与非挥发性物质的相互作用,一般来讲,挥发性有机物质是食品具有特殊香气和风味的主要原因[3],因此对于食醋中挥发性风味物质的研究具有重要意义。

样品前处理是食品分析过程中最重要的前处理过程,会直接影响到测量结果的准确性。固相微萃取技术集采样、萃取、浓缩、进样于一体[4],操作简便,快速,不需要溶剂提取[5],灵敏度高,属于环境友好型的样品前处理方式。其中,静态顶空固相微萃取(headspace solid phase microextraction,HS-SPME)被广泛用于分析环境[5-6]、食品[7-10]、医药[11-12]等具有挥发特性的样品中的风味成分。HS-SPME过程主要分为两步:即吸附过程和脱附过程,前者是挥发性物质根据“相似相溶”的原理吸附到涂有特定涂层的萃取头上,后者则是萃取头在一定条件下将被萃取成分解吸后再被分析。影响HS-SPME的提取效果的参数[13]主要有:涂层纤维的种类、NaCl添加量、搅拌速度、萃取温度、萃取时间、平衡时间(被萃取物质与体系之间的动态平衡时间)、解吸时间。此外,涂层的厚度、样品pH值、进样口衬管类型、样品体积、萃取头插入样品瓶的深度等都会对萃取结果有影响,因此在对样品进行分析时要保证分析条件的一致性。

目前,利用HS-SPME与各种分析方法联用分析不同种类醋的挥发性风味物质己有文献报道,例如Al-Dalali等[14]采用SPME-气相色谱-质谱(gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)以及气相色谱-嗅闻(GC-olfactometry,GC-O)联用方法分析了镇江香醋在传统和现代陈化方法下的风味物质的变化;Zhang Xin等[15]用HS-SPME-GC-MS联用法以及主成分分析法分析了北京米醋的香味标志物;Liang Xu等[8]利用多次顶空-SPMEGC-氢火焰离子方法分析了不同种类醋中四甲基吡嗪的总含量;范梦蝶等[16]采用HS-SPME-GC-MS和GC-O对山西老陈醋晒制前后风味物质的变化进行了分析。然而,到目前为止,对水塔陈醋中挥发性风味成分研究报道较少,水塔老陈醋产于山西省清徐县,选用优质高梁、大麦、豌豆等五谷经蒸、酵、熏、淋、晒的过程酿造而成,发展历史源远流长,至今己有3 000余年的历史,素有“天下第一醋”的盛誉。因此,本研究通过对HSSPME中萃取头种类、解吸时间、NaCl添加量、萃取时间、萃取温度5 个因素的优化,结合香气活度值(odor activity value,OAV)研究水塔陈醋中的主要挥发性物质及所起的作用,对于今后控制水塔陈醋的产品质量以及发酵过程工艺改进提供一定的参考作用。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

水塔陈醋 山西水塔醋业股份有限公司;NaCl(分析纯) 北京北化精细化学品有限公司;C8～C40正构烷烃 北京百灵威科技有限公司;2-辛醇(分析纯,≥97.0%) 默克生命科学(上海)有限公司。

1.2 仪器与设备

7890-5977 GC-MS联用仪、HP-5ms色谱柱(30 m×250 μm,0.25 μm) 美国Agilent公司;SPME进样手柄,50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷(divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane,DVB/CAR/PDMS)、100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB萃取纤维头 美国Supelco公司;固相微萃取装置(LCD数控加热型磁力搅拌器)、20 mL顶空瓶(聚四氟乙烯硅胶垫) 大龙兴创实验仪器(北京)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品准备

将水塔陈醋样品稀释10 倍常温保存备用。取7 mL稀释后的样品加入20 mL顶空瓶中,并加入适量的NaCl,放入磁力搅拌子,每次萃取前预平衡20 min,使被分析物质在样品基质与顶空瓶上达到平衡状态。

1.3.2 HS-SPME条件

100 μm PDMS、75 μm CAR/PDMS、65 μm PDMS/DVB、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纤维头每次使用前按分别在进样口温度250、300、250 ℃和260 ℃老化0.5、1、0.5 h和1 h。磁力搅拌器恒定400 r/min,随后通过进样手柄将老化好的萃取头插入顶空瓶中,推出纤维头,在一定温度和一定萃取时间吸附挥发性物质。每次实验至少重复3 次。

1.3.3 GC-MS条件

GC条件:HP-5ms毛细管色谱柱(30 m×250 μm,0.25 μm);进样口温度250 ℃,采用不分流进样,5 min后吹扫流量20 mL/min;载气为高纯氦气,柱流量1 mL/min;程序升温条件:初始柱温箱40 ℃,保持5 min,以8 ℃/min速率升至120 ℃/min,保持2 min;以20 ℃/min升至140 ℃后再以9 ℃/min升至250 ℃,保持1 min。后运行条件为250 ℃、5 min。

MS条件:电子电离源;离子源温度230 ℃;单四极杆温度150 ℃;离子传输管温度280 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 35～600,全扫描模式。

1.3.4 HS-SPME提取参数的优化

4 种不同的萃取纤维头老化后参照文献[17]萃取条件,分别在加NaCl 1.5 g、50 ℃金属浴条件下萃取40 min,根据总离子流色谱图谱选择最佳的萃取纤维头。然后经单因素试验考察NaCl添加量、萃取时间、萃取温度、解吸时间,考察范围分别为0～2.5 g、30～90 min、40～100 ℃、4～7 min,以总峰面积与有效化合物个数为指标,确定各因素最佳水平。

1.3.5 定性分析

总离子流色谱图用Agilent MassHunter Qualitative Analysis Workstation B.07.00分析,经色谱解卷积算法识别化合物,对照标准谱库NIST14检索化合物(分数＞80 分),C8～C40正构烷烃与样品同样程序升温条件,经Agilent定量分析软件计算各化合物相对保留指数,结合保留指数与质谱库同时对化合物进行定性分析。

1.3.6 定量分析

2-辛醇为内标,各化合物峰面积与内标峰面积比计算各化合物的相对含量。

1.3.7 OVA的计算

按下式计算OAV:

式中:Ci为各化合物的相对含量/(μg/L);OTi为该化合物在空气中的嗅觉阈值/(μg/L)。

1.4 数据处理

利用Graphpad 6.02作图,SPSS 24分析数据。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME纤维头的选择

图1 4 种不同极性萃取头对水塔陈醋挥发性风味物质分析Fig. 1 TIC profiles of volatile flavor substances from Shuita-branded vinegar extracted with four extraction fibers with different polarities

图2 萃取纤维头对水塔陈醋挥发性物质的萃取结果的影响Fig. 2 Effect of different extraction fibers on extraction efficiency of volatile substances from Shuita-branded vinegar

如图1、2所示,4 种萃取头对水塔陈醋挥发性成分萃取效果有明显区别,100 μm PDMS和75 μm CAR/PDMS萃取头对食醋样品挥发性物质的通量与敏感性明显劣于65 μm PDMS/DVB和50/30 μm DVB/CAR/PDMS,后两者峰数量明显增多。由图2可知,CAR/PDMS萃取头峰面积最大,但是化合物个数最少,只有7 个;DVB/CAR/PDMS、PDMS/DVB、PDMS峰面积逐级递减,PDMS萃取头有效化合物个数较少,PDMS/DVB次之,DVB/CAR/PDMS萃取的化合物个数最多且峰面积最大,表明DVB/CAR/PDMS对于萃取水塔陈醋挥发性化合物更有效,这一结果与之前研究结果也符合[18-19]。因此综合考虑本实验确定50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头进行后续分析。

2.2 HS-SPME单因素试验结果

2.2.1 解吸时间的选择

图3 解吸时间对水塔陈醋挥发性成分的影响Fig. 3 Effect of desorption time on detection of volatile components of Shuita-branded vinegar

由图3可知,解吸时间对于水塔陈醋挥发性化合物总峰面积及化合物个数影响不大,因此本实验确定解吸时间为5 min,即柱温箱在初始温度保持5 min之后打开吹扫阀吹扫掉多余物质。每次萃取针头在进样口解吸5 min之后多停留2～3 min以尽可能避免萃取头上还有其余干扰物质。

2.2.2 NaCl添加量的选择

图4 NaCl添加量对水塔陈醋挥发性风味物质的影响Fig. 4 Effect of NaCl addition on detection of volatile flavor substances of Shuita-branded vinegar

HS-SPME过程中,可以对样品进行适当的改性,例如可以通过加入适量的无机盐((NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl、H2CO3等)降低有机化合物与基质的亲和力,使其更易于从基质中分离出以提高萃取效率。为避免其他离子的干扰,本研究选用NaCl对样品进行改性增加醋样溶液的分配系数。如图4所示,随着NaCl添加量的增加,总峰面积持续增加,化合物个数在2 g左右较为稳定,实验过程中当NaCl添加量达到2.5 g时,由于样品体积一定,部分盐己不能完全溶解,说明此时盐溶液己趋于饱和,原则上,由于盐析作用,过饱和盐溶液使得分析物可以更有效地进入萃取纤维[13],因此确定最优加盐量为2.5 g。

2.2.3 萃取时间的选择

如图5所示,在NaCl添加量2.5 g、萃取温度50 ℃条件下,在30～80 min之间,随着萃取时间的延长,总峰面积及化合物个数都呈增加趋势,在80 min之后,总峰面积基本趋于平稳,化合物个数有上下波动,经SPSS 24软件单因素方差分析,80、90 min和100 min三水平化合物个数之间F值为2.177,P＝0.195＞0.05,表明三水平之间化合物个数没有显著差异。可能原因是萃取体系中被萃取物质与萃取头固定相间己经达到饱和,尽管延长萃取时间,化合物个数变化不大,因此确定80 min为最佳萃取时间。

图5 萃取时间对水塔陈醋挥发性风味物质的影响Fig. 5 Effect of extraction time on detection of volatile flavor substances of Shuita-branded vinegar

2.2.4 萃取温度的选择

图6 萃取温度对水塔陈醋挥发性成分的影响Fig. 6 Effects of extraction temperature on detection of volatile components of Shuita-branded vinegar

如图6所示,在NaCl添加量2.5 g、萃取时间80 min条件下,40～80 ℃,总峰面积和化合物个数总体趋势呈平稳增长;80 ℃以后,峰面积基本保持不变,化合物个数经SPSS 24单因素方差分析,F值为3.961,P值为0.080(＞0.05),表明80、90 ℃和100 ℃之间化合物个数无显著差异。萃取温度过高可能会导致某些化合物分解,因此确定最佳萃取温度为80 ℃。

2.3 水塔陈醋挥发性风味物质分析

图7 最优条件萃取水塔陈醋挥发性成分色谱图Fig. 7 TIC patterns of volatile components of Shuita-branded vinegar extracted under optimal conditions

应用最优条件对水塔陈醋挥发性风味成分进行分析,结果见图7。经谱库检索识别化合物共鉴定出75 种挥发性物质,如表1所示。其中包括酯类16 种、醛类15 种、酸类12 种、杂环类10 种、醇类6 种、酮类10 种、酚类3 种和醚类3 种。酸味不论是味觉上还是嗅觉上都是醋类产品的最直观、最经典的味道,也是影响醋类风味和品质的一类化合物。由表1可知,醋中酸味物质主要有醋酸(4.39 μg/L)、苯甲酸(6.22 μg/L)、辛酸(1.16 μg/L)、月桂酸(0.22 μg/L)、癸酸(0.45 μg/L)、壬酸(0.80 μg/L)等,辛酸具有奶酪味及少许的涩味,癸酸有令人不愉快的脂肪味[20],月桂酸具有月桂油香味。除此之外,醋酸相对含量虽然较低,但是其阈值较低,对于水塔陈醋产品风味影响很大,这些酸类物质在水塔陈醋中互相作用,互相影响从而赋予水塔陈醋独特的酸味成分。

酯类化合物在香味中占有特别重要的地位,大多具有花香、果香、酒香或蜜香香气,是评价醋类产品的一个主要指标。水塔陈醋中共鉴定出16 种化合物,是所有鉴定出化合物种类最多的,其中相对含量较高的是2-氯乙基苯甲酸酯(5.30 μg/L)、苯甲酰异硫氰酸酯(4.55 μg/L)、4-庚基丁基邻苯二甲酸酯(1.87 μg/L)、5-羟基-2,4-二丁基苯基酯(1.43 μg/L)、乙酸乙酯(0.54 μg/L)等,不同酯类物质的不同气味为水塔陈醋贡献其特殊的风味。

另外,水塔陈醋中还含有醛酮类、醇酚类、醚类等化合物。3-呋喃甲醛、苯甲醛在醛类化合物中相对含量较高,分别占6.40 μg/L和4.78 μg/L,有研究表明,3-呋喃甲醛、5-甲基糠醛、2-乙基-1-己醇是羟甲基糠醛的衍生物[21],可能是水塔陈醋在发酵过程经过美拉德反应生成的黑色物质,可以给食醋增香调色,但是过量对于身体健康会有副作用[22];苯甲醛有杏仁味[23],苯乙醛具有浓郁的玉簪花香气,壬醛有玫瑰花香[24-25];苯乙醇是醇类化合物中相对含量最高的物质,占3.64 μg/L,具有玫瑰香、紫罗兰香、茉莉花香等多种风味,可由苯丙氨酸经Strecker降解产生的苯乙醛还原生成;4-乙烯基-2-甲氧基苯酚具有强烈的丁香和发酵似香气[26]。二甲基三硫醚是蛋氨酸降解产生的甲硫醇进一步转化产生,是蛋氨酸经过酵母代谢的中间产物;此外,美拉德反应经Strecker降解反应生成的醛类与氨基化合物进行醛基-氨基反应生成类黑精的同时,还有一系列中间体及杂环化合物的生成,对食品的风味起着重要的作用,四甲基吡嗪(川穹嗪)是杂环类风味物质中变化最大的物质,有降低血压、改善脑循环、抗肿瘤等功效[27],具有坚果香和烧烤香味[8]。这些化合物共同作用赋予了水塔陈醋独特的香味成分与营养功能。

表1 水塔陈醋挥发性风味成分GC-MS分析结果Table 1GC-MS analysis of volatile compounds in Shuita-branded vinegar

续表1

2.4 OAV计算鉴定香气活性成分

OAV即化合物的香气浓度与其阈值的比值,阈值是指能嗅到或检测到的该化合物的最低浓度[28-29]。一般认为OAV大于或等于1时,表明该化合物对该物质香气成分有贡献作用。在水塔陈醋检索出的75 种化合物中,有21 种化合物OAV大于1,主要为酸类和醛类物质,另外还有醇酚醚以及杂环类,结果如表2所示。

酸类物质如戊酸、辛酸、2-甲基丁酸OAV较高,分别为5 194.77、229.91、118.51,这些酸类物质提供水塔陈醋特殊的风味以及独特的酸味口感;醛类物质如癸醛、香草醛、壬醛OAV分别为155.73、114.79、59.86,有研究表明,C9～C12饱和醛在高度稀释下具有良好的香气特征[30]。另外,苯酚及草蒿脑都具有较高的OAV,分别为1 564.06、4 824.21,这些呈香能力较强的物质提供了水塔陈醋独特的风格特征。这些化合物值得进一步重点关注,其余化合物OAV虽低,但也都以一定比例相互协调发挥各自的作用。

表2 OAV确定水塔陈醋中挥发性风味成分Table 2Potent odorants in Shuita-branded vinegar identi fied by OAV

3 结 论

本研究采用HS-SPME-GC-MS对水塔陈醋中挥发性物质进行分析。通过优化萃取条件分析水塔陈醋挥发性风味成分,确定最优萃取条件为NaCl添加量2.5 g,水塔陈醋用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在80 ℃金属浴萃取80 min。共鉴定出75 种化合物,酯类最多(16 种)、醛类次之(15 种),此外还检测出酸类(12 种)、酮类(10 种)、杂环类(10 种)、醇类(6 种)、酚类(3 种)、醚类(3 种)。这些物质对于醋类的特殊气味都有重要贡献。相较于优化之前,化合物个数有明显提升(25 种→75 种),总峰面积也随之增加(4.57×108→1.01×109),表明萃取条件的优化对于水塔陈醋挥发性成分有显著影响。水塔陈醋中挥发性物质种类复杂多样,从OAV结果看,有21 种化合物OAV大于1,其中辛酸、癸酸、戊酸、醋酸等酸类物质为水塔陈醋提供了独特的酸味;另外苯乙醇、糠醛、苯乙醛、四甲基吡嗪等物质共同作用赋予水塔陈醋其特有的风味及口感。这些呈香物质为研究水塔陈醋的特征香味成分以及加工工艺优化提供一定的理论参考。但由于醋类发酵过程中受到发酵工艺、发酵菌落、陈酿时间等因素的影响,对挥发性化合物具体产生来源、途径及相互之间的作用仍需要进一步研究。