2-巯基苯并噻唑荧光增敏法检测过氧化氢含量及过氧化氢酶活力

吕雅娟，袁瑞青，李志英*

（1.山西医科大学 汾阳学院，山西 汾阳 032200；2.忻州师范学院 化学系，山西 忻州 034000）

过氧化氢是公认的低毒物质，可用作漂白剂、消毒剂、脱氧剂，也可作食品添加剂。植物在自身代谢中产生过氧化氢（H2O2）需及时清除，否则对植物细胞产生危害。而植物中也存在过氧化氢酶，它能催化过氧化氢分解[1]，起清除过氧化氢的作用。过氧化氢酶（CAT）活性的测定在此之前已有不少报道，如：荧光分析法[2]、水杨酸法[3]、分光光度法[4]、Warburg法[5]、钼酸铵法[6]等。这些方法要推广应用存在一定的局限性，如操作繁琐、工作量大、仪器设备昂贵、测定体系复杂等问题，在实际应用中受到限制。而利用荧光分析法测定过氧化氢酶的活性报道较少，因此，研究一种测定蔬菜水果中过氧化氢酶活性的方法是非常必要的。

2-巯基苯并噻唑是是一种化学分析的试剂，分子式是C7H5NS2，可作为通用型硫化促进剂，广泛用于各种橡胶制品，也可与1-氨基-4-硝基蒽醌和碳酸钾可制得染料分散艳红S-GL，这种染料用于涤纶及其混纺织物的染色。2-巯基苯并噻唑用作电镀添加剂时又称酸性镀铜光亮剂M，在以硫酸铜为主盐的光亮镀铜时作为铺助光亮剂。此外，该品还用于制取农药杀真菌剂、氮肥增效剂、切消油和润滑添加剂、照相化学中的有机防灰化剂、金属腐蚀抑制剂等[7]，是一种非常重要的化学物质。

研究发现，在碱性条件下，2-巯基苯并噻唑几乎不发荧光，但加入H2O2后发生氧化反应使其荧光增强，蔬菜中提取的过氧化氢酶催化H2O2分解为H2O和O2，短时间内使得荧光强度减弱。因此，用2-巯基苯并噻唑-NaOH荧光增敏法检测过氧化氢的含量，并用过氧化氢含量的减少检测过氧化氢酶活性，此方法环保，操作简单方便。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

RF-5301PC荧光分光光度计，苏州岛津公司。

0.029 mol/L 过氧化氢溶液：取3 mL30%的过氧化氢(天津市福晨化学试剂厂，分析纯)于100 mL的容量瓶中定容配制成0.29 mol/L的贮备液，用高锰酸钾标准溶液标定，在2～8 ℃冰箱中避光保存，用时可稀释为0.029 mol/L 的工作液；氢氧化钠（天津市风船化学试剂科技有限公司，分析纯）；0.01 mol/L 2-巯基苯并噻唑溶液：准确称取0.1673 g 2-巯基苯并噻唑（天津市光复精细化工研究所，分析纯）于100 mL干燥的烧杯中，移取10 mL1.00 mol/L的氢氧化钠溶液溶解，蒸馏水定容到100 mL的容量瓶中，得0.01 mol/L溶液；新鲜的土豆、黄瓜、生菜均购于忻州师范学院西巷平价超市。

1.2 实验方法

1.2.1 过氧化氢含量的检测方法

取两支25 mL 的比色管，各加入0.01 mol/L 2-巯基苯并噻唑溶液1 mL，其中一支再加入1 mL 的0.029 mol/L H2O2定容至25 mL，在已设定为55 ℃的水浴锅中加热30 min，流水冷却5 min，在激发波长342 nm、发射波长430 nm处，测定荧光强度。不加过氧化氢溶液的荧光强度记为F，加入过氧化氢的溶液荧光强度记为F0，并计算荧光强度变化ΔF（ΔF=F0-F）。

1.2.2 过氧化氢酶的提取[8]

将被测的新鲜蔬菜样品称量后置于研钵中，加入少量石英砂和适量蒸馏水，充分研磨成匀浆后，转入25 mL容量瓶内，并用蒸馏水将研钵冲洗3～4次，洗涤液转入容量瓶中，定容到刻度线，混匀后在5 ℃冰箱内静置10 min。将研磨液转入几个10 mL塑料离心管中，在4000 r/min下离心15 min，上清液即为过氧化氢酶粗提液，于5 ℃冰箱内保存备用。

1.2.3 过氧化氢酶活性测定

取两支25 mL 的比色管，各加入H2O2溶液1 mL，其中一支加入过氧化氢酶提取液1 mL，在25 ℃的水浴下反应不同时间，充分振荡后，各加入1 mL 2-巯基苯并噻唑，定容到25 mL，在55 ℃水浴锅中反应30 min后用流水冷却5 min，测定荧光强度，计算荧光强度变化△F 及过氧化氢酶活。酶活计算公式[9]：C=25[(ΔF-77.26）/6.69]/t。式中，C为CAT活性，mol/min；t为反应时间，min。

2 结果与讨论

2.1 测定体系的荧光图谱

取两支25 mL 的比色管，各加入0.01 mol/L 2-巯基苯并噻唑溶液1 mL，其中一支再加入0.029 mol/L H2O25 mL定容至25 mL，在已设定为55 ℃的水浴锅中加热30 min，流水冷却5 min，在激发波长342 nm，测定荧光强度F和F0，并计算△F（△F=F0-F），结果如图1。从图1可以看出，2-巯基苯并噻唑在430 nm处有弱荧光，加入H2O2荧光增强。

图1 2-巯基苯并噻唑与H2O2荧光光谱图Figure 1 Fluorescence spectra of 2-mercaptobenzothiazole and H2O2

2.2 pH、温度、加热时间对测定体系的影响

在其它实验条件不变的情况下，按实验方法1.2.1用NaOH 和HCl调节溶液的pH分别为4、5、6、7、8、9、10、11、12，测定其荧光强度，并计算ΔF（ΔF=F0-F），结果如图2（A）。由图2（A）可知，酸性条件下荧光较弱，原因是2-巯基苯并噻唑在碱性条件才能溶解，但碱性太强H2O2不稳定，所以，pH=7～8时效果最好，而用酸度计测定体系的pH=7.5，加入H2O2也不会小于7，所以选择不加缓冲溶液。

配制同浓度的2-巯基苯并噻唑、2-巯基苯并噻唑+H2O2，在其它实验条件不变的情况下，按照1.2.1分别考察了反应温度分别为35、45、55、65、75 ℃，反应时间分别为10、20、30、40、50、60 min 荧光强度的变化（ΔF=F0-F），结果如图2（B）、（C）。实验结果表明：温度对反应影响很大，ΔF值随加热温度的升高逐渐增加，但温度过高过氧化氢分解，温度为55 ℃最佳。加热时间30 min后基本稳定，因此选择加热时间30 min。

图2 pH（A）温度（B）和加热时间（C）对荧光强度ΔF的影响Figure 2 Effect of pH（A）,temperature（B）and（C）time on fluorescence intensity △F

2.4 工作曲线与检出限

取25 mL 比色管，每支加入1 mL 2-巯基苯并噻唑溶液，再分别加入0.15、0.2、0.4、0.6、0.8、2、4、6、8、10 mL 的1 mol/L H2O2溶液，定容至25 mL，在55 ℃水浴锅中反应30 min，用流水冷却5 min，测定荧光强度，并作出工作曲线（图3）。求得回归方程和相关系数分别为：ΔF=6.69 c+67.26（mmol/L），r=0.9962，过氧化氢浓度在0.23～116 mmol/L范围内线性关系良好。平行测定11次不加过氧化氢的空白溶液，求得其相对标准偏差（Sr）为1.45%，检出限为6.73×10-5mol/L。

2.5 过氧化氢酶活性测定

图3 过氧化氢的工作曲线Figure 3 Working curve of hydrogen peroxide

各取5 kg洁净的土豆、生菜、黄瓜，按照1.2.2的方法提取过氧化氢酶，采用1.2.3的方法测定酶活，结果如表1，土豆、生菜、黄瓜过氧化氢酶活力分别为0.018、0.012、0.010 mol/min，表明蔬菜中过氧化氢酶活强度大小顺序为土豆＞生菜＞黄瓜。

表1 过氧化氢酶活的测定Tab.1 Determination of catalase activity

3 结论

利用2-巯基苯并噻唑-NaOH荧光增敏法测定过氧化氢含量,反应最佳温度为55 ℃，加热时间为30 min。在此基础上对三种蔬菜（土豆、生菜、黄瓜）中提取的过氧化氢酶活性进行测定，结果显示蔬菜中过氧化氢酶活性强弱顺序为土豆＞生菜＞黄瓜。与其他参考文献结果相比[9]，本方法简单、方便，不受环境影响。